编辑推荐
《分子克隆实验指南(原书第四版)(套装共2册)》包括《分子克隆实验指南·上册》、《分子克隆实验指南·下册》共2册。可作为学习遗传学、分子细胞生物学、发育生物学、微生物学、神经科学和免疫学等学科的重要指导，可供生物学、医药卫生，以及农、林、牧、渔、检验检疫等方面的科研、教学与技术人员参考。
作者简介
作者:（美）M.R.格林等主编；贺福初等
目录
《分子克隆实验指南·上册》目录：
第1章DNA的分离及定量
导言
方案1SDS碱裂解法制备质粒DNA：少量制备
方案2SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备
方案3从革兰氏阴性菌（如E.coli）中分离DNA
方案4乙醇法沉淀DNA
方案5异丙醇法沉淀DNA
方案6用微量浓缩机进行核酸的浓缩和脱盐
方案7丁醇抽提法浓缩核酸
方案8聚乙二醇沉淀法制备M13噬菌体单链DNA
方案9M13噬菌体铺平板
方案10M13噬菌体液体培养
方案11M13噬菌体双链（复制型）DNA的制备
方案12利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA
方案13用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA
方案14一步法同时提取细胞或组织中的DNA、RNA和蛋白质
方案15从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA
替代方案：不使用有机溶剂从鼠尾分离DNA
替代方案：一管法从鼠尾中分离DNA
方案16快速分离酵母DNA
方案17微型凝胶电泳后使用溴化乙锭（EB）估算条带中DNA数量
方案18利用Hoechst33258通过荧光分析仪估算DNA浓度
方案19用PicoGreen定量溶液中的DNA
信息栏
第2章DNA分析
导言
方案1琼脂糖凝胶电泳
方案2琼脂糖凝胶中DNA的染色检测
方案3聚丙烯酰胺凝胶电泳
方案4聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测
方案5聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测
方案6碱性琼脂糖凝胶电泳
附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影
方案7成像：放射自显影和感光成像
方案8用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA
方案9低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提法
方案10聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法
方案11Southern印迹
方案12Southern印迹：DNA从一块琼脂糖凝胶同时向两张膜转移
方案13采用放射性标记探针对固定在膜上的核酸DNA进行Southern杂交
附加方案：从膜上洗脱探针
信息栏
第3章质粒载体克隆与转化
导言
方案1制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法：高效转化策略
方案2制各和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：“超级感受态”细胞
方案3大肠杆菌的简单转化：纳米颗粒介导的转化
替代方案：一步法制备感受态大肠杆菌：在同一溶液中转化和储存细菌细胞
方案4电穿孔法转化大肠杆菌
方案5质粒载体克隆：定向克隆
方案6质粒载体克隆：平末端克隆
方案7质粒DNA的去磷酸化
方案8向平末端DNA添加磷酸化衔接子／接头
方案9克隆PCR产物：向扩增DNA的末端添加限制性酶切位点
方案10克隆PCR产物：平末端克隆
方案11克隆PCR产物：制备T载体
方案12克隆PCR产物：TA克隆
方案13克隆PCR产物：TOPOTA克隆
方案14使用X—Gal和IPTG筛选细菌菌落：α—互补
信息栏
第4章Gateway重组克隆
导言
方案1扩增Gateway载体
方案2制备可读框入门克隆和目的克隆
方案3应用多位点LR克隆反应制备目的克隆
信息栏
第5章细菌人工染色体及其他高容量载体的应用
导言
方案1BACDNA的小量分离和PCR检验
方案2BACDNA的大量制备和线性化
方案3通过脉冲电场凝胶电泳检验BACDNA的质量和数量
方案4两步BAC工程：穿梭载体DNA的制备
方案SA同源臂（A—Box）和B同源臂（B—Box）的制备
方案6克隆A和B同源臂到穿梭载体
方案7重组穿梭载体的制备和检验
方案8通过电穿孔法转化重组穿梭载体到感受态BAC宿主细胞
方案9共合体的检验和重组BAC克隆的筛选
方案10一步BAC修饰：质粒制备
方案11A同源臂（A—Box）的制备
方案12克隆A同源臂到报道穿梭载体
方案13用RecA载体转化BAC宿主
方案14转移报道载体到BAC／RecA细胞以及共合体的筛选
方案15酿酒酵母（S.cerevisiae）的生长和DNA制备
方案16酵母DNA的小量制备
信息栏
第6章真核细胞RNA的提取、纯化和分析
导言
方案1从哺乳动物的细胞和组织中提取总RNA
替代方案从小量样本提取RNA
方案2从斑马鱼胚胎和成体中提取总RNA
方案3从黑腹果蝇提取总RNA
方案4从秀丽隐杆线虫中提取总RNA
方案5从酿酒酵母菌中采用热酸酚提取总RNA
方案6RNA定量和储存
方案7RNA的乙醇沉淀
方案8通过无RNase的DNaseI处理去除RNA样品中的DNA污染
方案9Oligo（dT）磁珠法提取poly（A）+mRNA
方案10按照大小分离RNA：含甲醛的琼脂糖凝胶电泳
方案11根据分子质量大小分离RNA：RNA的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
方案12琼脂糖凝胶中变性RNA的转膜和固定
替代方案下行毛细管转移
方案13聚丙烯酰胺凝胶的电转移和膜固定
方案14Northern杂交
方案15纯化RNA的点杂交和狭缝杂交
方案16用核酸酶Sl对RNA作图
方案17核糖核酸酶保护分析：用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针对RNA作图
方案18引物延伸法分析RNA
信息栏
第7章聚合酶链反应
导言
方案1基础PCR
方案2热启动PCR
方案3降落PCR
方案4高GC含量模板的PCR扩增
方案5长片段高保真PCR（LAPCR）
方案6反向PCR
方案7巢式PCR
方案8mRNA反转录产物cDNA的扩增：两步法RT—PCR
方案9由mRNA的5’端进行序列的快速扩增：5’—RACE
方案10由mRNA的3’端进行序列的快速扩增：3’—RACE
方案11使用PCR筛选克隆
信息栏
第8章生物信息学
导言
方案1使用UCSC基因组浏览器将基因组注释可视化
方案2使用BLAST和ClustalW进行序列比对和同源性检索
方案3使用Primer3Plus设计PCR引物
方案4使用微阵列和RNA—seq进行表达序列谱分析
方案5将上亿短读段定位至参考基因组上
方案6识别ChIP—seq数据集中富集的区域（寻峰）
方案7发现顺式调控基序
信息栏
第9章实时荧光聚合酶链反应定量检测DNA及RNA
导言
方案1实时PCR反应用引物和探针浓度的优化
方案2制作标准曲线
方案3实时荧光PCR定量检测DNA
方案4实时荧光PCR定量检测RNA
方案5实时荧光PCR实验数据的分析和归一化
信息栏
第10章核酸平台技术
导言
方案1印制微阵列
方案2RoundA／RoundBDNA扩增
方案3核小体DNA和其他小于500bp的DNA的T7线性扩增（TLAD）
方案4RNA的扩增
方案5RNA的Cyanine—dUTP直接标记
方案6RNA的氨基烯丙基—dUTP间接标记
方案7用Klenow酶对DNA进行Cyanine—dCTP标记
方案8DNA的间接标记
方案9封闭自制微阵列上的多聚赖氨酸
方案10自制微阵列的杂交
第11章DNA测序
导言
方案1毛细管测序质粒亚克隆的制备
方案2毛细管测序之PCR产物的制备
方案3循环测序反应
方案4全基因组：手工文库制备
方案5全基因组：自动化的无索引文库制备
附加方案自动化的文库制备
方案6全基因组：自动化的带索引文库制备
方案7用于Illumina测序的3kb末端配对文库的制备
方案8用于Illumina测序的8kb末端配对文库的制备
附加方案AMPure磁珠校准
方案9RNA—Seq：RNA反转录为cDNA及其扩增
附加方案RNACleanXP磁珠纯化（RNA—Seq前）
方案10液相外显子组捕获
附加方案AMPureXP磁珠纯化
附加方案琼脂糖凝胶大小筛选
方案11自动化大小筛选
方案12用SYBRGreen—qPCR进行文库定量
方案13用PicoGreen荧光法进行文库DNA定量
方案14文库定量：用Qubit系统对双链或单链DNA进行荧光定量
方案15为454测序制备小片段文库
方案16单链DNA文库的捕获及emPCR
方案17Roche／454测序：执行一个测序运行
方案18结果有效性确认
方案19测序数据的质量评估
方案20数据分析
信息栏
……
《分子克隆实验指南·下册》
文摘
版权页：
插图：
引物延伸
引物延伸法主要用于mRNA 5’端作图。制备的poly （A）+RNA先与过量5，端放射性标记的、与靶RNA互补的单链寡核苷酸引物杂交，然后用反转录酶延伸引物。产生的cDNA与RNA模板互补，并与寡核苷酸引物5’端和RNA 5’端之间的距离相等。
以往引物延伸也用于其他目的：测定某个靶mRNA的丰度，确定mRNA的前体和加工中间体（综述见Boorstein and Craig 1989）。然而，由于有更高的灵敏度，现在更优先使用核糖核酸酶保护和核酸酶S1实验。尽管如此，在mRNA 5，端作图时引物延伸法仍为首选方法。一旦引物被起始合成，延伸反应大多会进行到RNA模板的5，端，产物的大小可以被高精度测定。此外，产物的长度不会受到靶基因内含子分部和大小的影响，而这能通过与基因组模板杂交来干扰mRNA的作图。在依赖于杂交体消化的实验中，如核酸酶Sl和核糖核酸酶保护，mRNA 5’端的短外显子很容易被遗漏。
几乎所有的引物延伸反应实验都采用20～30nt的合成寡核苷酸引物（更多细节见第13章）。当用于和靶序列杂交的寡核苷酸引物位于距mRNA 5端150nt以内时，可以获得最佳结果。由于反转录酶会在模板RNA的高度二级结构区域停顿和终止，在更远的距离处杂交会生成不均一的延伸产物。因此，在设计引物时，除实际的序列外，还要考虑到杂交的位置。应尽可能使寡核苷酸引物的GC含量在50%左右，且在3，端为G或C。用两个引物在mRNA相距一段已知距离（如20～50nt）的区域上分别杂交则更为理想。大小差别等于两个引物间距的延伸产物为结果提供了佐证。为了找到一对能产生明确延伸产物的引物，合成多个引物是有必要的。
优化引物延伸反应
在多数情况下，延伸反应会产生两个产物：全长的cDNA分子和短1～2bp的反转录产物。这可能代表着多个转录起始位点导致的mRNA 5’端的不均一性。或者，在邻近靶mRNA加帽位点的甲基化残基处提前终止延伸反应会产生更短的分子。与帽子相关的条带的化学计量在不同的mRNA样品中可能是不同的，但是对于一份给定的样品通常是不变的。为了区分反转录假象和真正的5’端不均一性，用5’端标记的探针（见方案16）进行核酸酶S1分析是一个很好的方法（如果不需要得到用于发表的结果）。
与未进一步分离的哺乳动物RNA相比，用poly （A）+样品可得到清晰得多的结果，因为前者常会产生多到不可接受的提前终止延伸产物。通过在更高浓度（5mmol／L） dNTP下进行延伸反应，以及采用互补区位于mRNA 5’端50～100nt以内的引物，可以将假象降至最低。
《分子克隆实验指南(原书第四版)(套装共2册)》包括《分子克隆实验指南·上册》、《分子克隆实验指南·下册》共2册。可作为学习遗传学、分子细胞生物学、发育生物学、微生物学、神经科学和免疫学等学科的重要指导，可供生物学、医药卫生，以及农、林、牧、渔、检验检疫等方面的科研、教学与技术人员参考。
作者简介
作者:（美）M.R.格林等主编；贺福初等
目录
《分子克隆实验指南·上册》目录：
第1章DNA的分离及定量
导言
方案1SDS碱裂解法制备质粒DNA：少量制备
方案2SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备
方案3从革兰氏阴性菌（如E.coli）中分离DNA
方案4乙醇法沉淀DNA
方案5异丙醇法沉淀DNA
方案6用微量浓缩机进行核酸的浓缩和脱盐
方案7丁醇抽提法浓缩核酸
方案8聚乙二醇沉淀法制备M13噬菌体单链DNA
方案9M13噬菌体铺平板
方案10M13噬菌体液体培养
方案11M13噬菌体双链（复制型）DNA的制备
方案12利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA
方案13用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA
方案14一步法同时提取细胞或组织中的DNA、RNA和蛋白质
方案15从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA
替代方案：不使用有机溶剂从鼠尾分离DNA
替代方案：一管法从鼠尾中分离DNA
方案16快速分离酵母DNA
方案17微型凝胶电泳后使用溴化乙锭（EB）估算条带中DNA数量
方案18利用Hoechst33258通过荧光分析仪估算DNA浓度
方案19用PicoGreen定量溶液中的DNA
信息栏
第2章DNA分析
导言
方案1琼脂糖凝胶电泳
方案2琼脂糖凝胶中DNA的染色检测
方案3聚丙烯酰胺凝胶电泳
方案4聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测
方案5聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测
方案6碱性琼脂糖凝胶电泳
附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影
方案7成像：放射自显影和感光成像
方案8用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA
方案9低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提法
方案10聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法
方案11Southern印迹
方案12Southern印迹：DNA从一块琼脂糖凝胶同时向两张膜转移
方案13采用放射性标记探针对固定在膜上的核酸DNA进行Southern杂交
附加方案：从膜上洗脱探针
信息栏
第3章质粒载体克隆与转化
导言
方案1制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法：高效转化策略
方案2制各和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：“超级感受态”细胞
方案3大肠杆菌的简单转化：纳米颗粒介导的转化
替代方案：一步法制备感受态大肠杆菌：在同一溶液中转化和储存细菌细胞
方案4电穿孔法转化大肠杆菌
方案5质粒载体克隆：定向克隆
方案6质粒载体克隆：平末端克隆
方案7质粒DNA的去磷酸化
方案8向平末端DNA添加磷酸化衔接子／接头
方案9克隆PCR产物：向扩增DNA的末端添加限制性酶切位点
方案10克隆PCR产物：平末端克隆
方案11克隆PCR产物：制备T载体
方案12克隆PCR产物：TA克隆
方案13克隆PCR产物：TOPOTA克隆
方案14使用X—Gal和IPTG筛选细菌菌落：α—互补
信息栏
第4章Gateway重组克隆
导言
方案1扩增Gateway载体
方案2制备可读框入门克隆和目的克隆
方案3应用多位点LR克隆反应制备目的克隆
信息栏
第5章细菌人工染色体及其他高容量载体的应用
导言
方案1BACDNA的小量分离和PCR检验
方案2BACDNA的大量制备和线性化
方案3通过脉冲电场凝胶电泳检验BACDNA的质量和数量
方案4两步BAC工程：穿梭载体DNA的制备
方案SA同源臂（A—Box）和B同源臂（B—Box）的制备
方案6克隆A和B同源臂到穿梭载体
方案7重组穿梭载体的制备和检验
方案8通过电穿孔法转化重组穿梭载体到感受态BAC宿主细胞
方案9共合体的检验和重组BAC克隆的筛选
方案10一步BAC修饰：质粒制备
方案11A同源臂（A—Box）的制备
方案12克隆A同源臂到报道穿梭载体
方案13用RecA载体转化BAC宿主
方案14转移报道载体到BAC／RecA细胞以及共合体的筛选
方案15酿酒酵母（S.cerevisiae）的生长和DNA制备
方案16酵母DNA的小量制备
信息栏
第6章真核细胞RNA的提取、纯化和分析
导言
方案1从哺乳动物的细胞和组织中提取总RNA
替代方案从小量样本提取RNA
方案2从斑马鱼胚胎和成体中提取总RNA
方案3从黑腹果蝇提取总RNA
方案4从秀丽隐杆线虫中提取总RNA
方案5从酿酒酵母菌中采用热酸酚提取总RNA
方案6RNA定量和储存
方案7RNA的乙醇沉淀
方案8通过无RNase的DNaseI处理去除RNA样品中的DNA污染
方案9Oligo（dT）磁珠法提取poly（A）+mRNA
方案10按照大小分离RNA：含甲醛的琼脂糖凝胶电泳
方案11根据分子质量大小分离RNA：RNA的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
方案12琼脂糖凝胶中变性RNA的转膜和固定
替代方案下行毛细管转移
方案13聚丙烯酰胺凝胶的电转移和膜固定
方案14Northern杂交
方案15纯化RNA的点杂交和狭缝杂交
方案16用核酸酶Sl对RNA作图
方案17核糖核酸酶保护分析：用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针对RNA作图
方案18引物延伸法分析RNA
信息栏
第7章聚合酶链反应
导言
方案1基础PCR
方案2热启动PCR
方案3降落PCR
方案4高GC含量模板的PCR扩增
方案5长片段高保真PCR（LAPCR）
方案6反向PCR
方案7巢式PCR
方案8mRNA反转录产物cDNA的扩增：两步法RT—PCR
方案9由mRNA的5’端进行序列的快速扩增：5’—RACE
方案10由mRNA的3’端进行序列的快速扩增：3’—RACE
方案11使用PCR筛选克隆
信息栏
第8章生物信息学
导言
方案1使用UCSC基因组浏览器将基因组注释可视化
方案2使用BLAST和ClustalW进行序列比对和同源性检索
方案3使用Primer3Plus设计PCR引物
方案4使用微阵列和RNA—seq进行表达序列谱分析
方案5将上亿短读段定位至参考基因组上
方案6识别ChIP—seq数据集中富集的区域（寻峰）
方案7发现顺式调控基序
信息栏
第9章实时荧光聚合酶链反应定量检测DNA及RNA
导言
方案1实时PCR反应用引物和探针浓度的优化
方案2制作标准曲线
方案3实时荧光PCR定量检测DNA
方案4实时荧光PCR定量检测RNA
方案5实时荧光PCR实验数据的分析和归一化
信息栏
第10章核酸平台技术
导言
方案1印制微阵列
方案2RoundA／RoundBDNA扩增
方案3核小体DNA和其他小于500bp的DNA的T7线性扩增（TLAD）
方案4RNA的扩增
方案5RNA的Cyanine—dUTP直接标记
方案6RNA的氨基烯丙基—dUTP间接标记
方案7用Klenow酶对DNA进行Cyanine—dCTP标记
方案8DNA的间接标记
方案9封闭自制微阵列上的多聚赖氨酸
方案10自制微阵列的杂交
第11章DNA测序
导言
方案1毛细管测序质粒亚克隆的制备
方案2毛细管测序之PCR产物的制备
方案3循环测序反应
方案4全基因组：手工文库制备
方案5全基因组：自动化的无索引文库制备
附加方案自动化的文库制备
方案6全基因组：自动化的带索引文库制备
方案7用于Illumina测序的3kb末端配对文库的制备
方案8用于Illumina测序的8kb末端配对文库的制备
附加方案AMPure磁珠校准
方案9RNA—Seq：RNA反转录为cDNA及其扩增
附加方案RNACleanXP磁珠纯化（RNA—Seq前）
方案10液相外显子组捕获
附加方案AMPureXP磁珠纯化
附加方案琼脂糖凝胶大小筛选
方案11自动化大小筛选
方案12用SYBRGreen—qPCR进行文库定量
方案13用PicoGreen荧光法进行文库DNA定量
方案14文库定量：用Qubit系统对双链或单链DNA进行荧光定量
方案15为454测序制备小片段文库
方案16单链DNA文库的捕获及emPCR
方案17Roche／454测序：执行一个测序运行
方案18结果有效性确认
方案19测序数据的质量评估
方案20数据分析
信息栏
……
《分子克隆实验指南·下册》
文摘
版权页：
插图：
引物延伸
引物延伸法主要用于mRNA 5’端作图。制备的poly （A）+RNA先与过量5，端放射性标记的、与靶RNA互补的单链寡核苷酸引物杂交，然后用反转录酶延伸引物。产生的cDNA与RNA模板互补，并与寡核苷酸引物5’端和RNA 5’端之间的距离相等。
以往引物延伸也用于其他目的：测定某个靶mRNA的丰度，确定mRNA的前体和加工中间体（综述见Boorstein and Craig 1989）。然而，由于有更高的灵敏度，现在更优先使用核糖核酸酶保护和核酸酶S1实验。尽管如此，在mRNA 5，端作图时引物延伸法仍为首选方法。一旦引物被起始合成，延伸反应大多会进行到RNA模板的5，端，产物的大小可以被高精度测定。此外，产物的长度不会受到靶基因内含子分部和大小的影响，而这能通过与基因组模板杂交来干扰mRNA的作图。在依赖于杂交体消化的实验中，如核酸酶Sl和核糖核酸酶保护，mRNA 5’端的短外显子很容易被遗漏。
几乎所有的引物延伸反应实验都采用20～30nt的合成寡核苷酸引物（更多细节见第13章）。当用于和靶序列杂交的寡核苷酸引物位于距mRNA 5端150nt以内时，可以获得最佳结果。由于反转录酶会在模板RNA的高度二级结构区域停顿和终止，在更远的距离处杂交会生成不均一的延伸产物。因此，在设计引物时，除实际的序列外，还要考虑到杂交的位置。应尽可能使寡核苷酸引物的GC含量在50%左右，且在3，端为G或C。用两个引物在mRNA相距一段已知距离（如20～50nt）的区域上分别杂交则更为理想。大小差别等于两个引物间距的延伸产物为结果提供了佐证。为了找到一对能产生明确延伸产物的引物，合成多个引物是有必要的。
优化引物延伸反应
在多数情况下，延伸反应会产生两个产物：全长的cDNA分子和短1～2bp的反转录产物。这可能代表着多个转录起始位点导致的mRNA 5’端的不均一性。或者，在邻近靶mRNA加帽位点的甲基化残基处提前终止延伸反应会产生更短的分子。与帽子相关的条带的化学计量在不同的mRNA样品中可能是不同的，但是对于一份给定的样品通常是不变的。为了区分反转录假象和真正的5’端不均一性，用5’端标记的探针（见方案16）进行核酸酶S1分析是一个很好的方法（如果不需要得到用于发表的结果）。
与未进一步分离的哺乳动物RNA相比，用poly （A）+样品可得到清晰得多的结果，因为前者常会产生多到不可接受的提前终止延伸产物。通过在更高浓度（5mmol／L） dNTP下进行延伸反应，以及采用互补区位于mRNA 5’端50～100nt以内的引物，可以将假象降至最低。
| ISBN | 9787030483294 |
|---|---|
| 出版社 | 科学出版社 |
| 作者 | M.R.格林 (Michael R.Green) |
| 尺寸 | 16 |