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《中国自然多倍体泥鳅的遗传学研究》编辑推荐：泥鳅的天然多倍体与二倍体共存的现象使之成为研究鱼类的细胞地理学、发育生物学和遗传育种学等领域的理想原材料。
作者简介
李雅娟，系大连海洋大学职工，李雅娟，博士，大连海洋大学水产与生命学院教授，承担国家“863”、国家自然科学基金、省重大、重点项目、省基金等多项科研项目。
目录
第1章绪论
1.1鱼类染色体的多倍性
1.2鱼类自然多倍体形成机制
1.3鱼类多倍体诱导
1.4人工诱导多倍体产生的方法
1.5多倍体的鉴定
1.6多倍体的生物学特性
1.7多倍体的应用
1.8多倍体泥鳅研究现状
第2章中国自然多倍体泥鳅的分布、染色体核型及形态特征
2.1中国自然多倍体泥鳅的分布
2.2中国自然多倍体泥鳅染色体核型及形态特征
第3章中国自然多倍体泥鳅线粒体DNA控制区的序列分析
3.1引言
3.2材料与方法
3.3结果
3.4讨论
第4章中国自然四倍体泥鳅分子细胞遗传学研究
4.1二倍体、四倍体泥鳅的银染核型
4.2CMA3／DA／DAPI三重荧光染色
4.3人5.8S+28SrDNA—FISH
第5章中国自然四倍体泥鳅染色体构成研究
5.1引言
5.2材料与方法
5.3结果
5.4讨论
第6章中国自然四倍体泥鳅染色体减数分裂行为
6.1引言
6.2材料与方法
6.3结果
6.4讨论
第7章中国自然多倍体泥鳅生殖特性研究
7.1引言
7.2材料与方法
7.3结果
7.4讨论
第8章不同倍性及亲子代泥鳅的DNA甲基化差异分析
8.1泥鳅MSAP技术反应体系的建立及优化
8.2不同倍性及亲子代泥鳅的DNA甲基化差异分析
第9章杂交三倍体泥鳅培育及染色体组稳定性研究
9.1杂交三倍体泥鳅早期胚胎染色体组成研究
9.2不同倍性泥鳅杂交后代染色体数目组成的研究
9.3二倍体泥鳅×四倍体泥鳅F1的不同发育阶段染色体核型分析
第10章杂交三倍体泥鳅减数分裂及配子染色体研究
10.1杂交三倍体泥鳅的减数分裂
10.2杂交三倍体泥鳅精母细胞染色体的带型及rDNA定位
第11章杂交三倍体泥鳅的生殖特性
11.1引言
11.2材料与方法
11.3结果
11.4讨论
第12章杂交三倍体泥鳅配子染色体组构成的研究
12.1引言
12.2材料与方法
12.3结果
12.4讨论
第13章不同倍性泥鳅鳍细胞系的建立及生物学特性分析
13.1引言
13.2材料与方法
13.3结果
13.4讨论
第14章氯化镉对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应
14.1引言
14.2材料与方法
14.3结果
14.4讨论
第15章杀虫单对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性作用
15.1引言
15.2材料与方法
15.3结果
15.4讨论
参考文献
附图
序言
第1章绪论
11鱼类染色体的多倍性
一个物种细胞中染色体形态结构和数目的恒定性是这个种的重要特征。二倍体生物在有性繁殖过程中，或者是生物体世代交替中，能维持配子正常功能的、最低数目的一套染色体（chromosome set）称为染色体组或基因组（genome）。进行有性生殖的生物把含有2套染色体组的称为二倍体（diploid，2n），含有3套、4套染色体组的生物分别称为3倍体（triploid,3n）和4倍体（tetraploid,4n）。多倍体（Polyploid）最早是由德国学者Winkler（1916）诱发植物多倍体成功后首先提出来的。它是指生物体体细胞中含有3套或3套以上染色体组的个体。由于多倍体生物具有比二倍体多出一倍或以上的基因和复等位基因的变异，所以拥有更高的代谢能力和物质合成能力。多倍化是生物进化变异的自然现象，也是促进生物发生进化改变的重要力量。据不完全统计，植物界中被子植物有30％～80%是多倍体，大约70%显花植物在进化过程中进行多倍化。但动物中的多倍体现象比较少。在低等动物中，如甲壳类中的盐水丰年虾为四倍体；线形动物中的马蛔虫为同源四倍体（4n=4）。昆虫中的多倍体现象又总是与孤雌生殖方式联系在一起。在水产动物中，多倍体现象比较普遍。世界上现存鱼类约有2万多种，已研究过染色体的鱼类约有1 100余种，其中多倍体至少有60种（桂建芳，1985；马纲，1996）。许多多倍体种类是重要的经济鱼类或重要的养殖对象。例如鲑科的虹鳟、白鲑、各种大麻哈鱼和茴鱼是四倍体；胭脂鱼科中几乎所有的种类都是四倍体；鲫鱼的变种—金鱼中除了四倍体外，还有三倍体如银金鱼。此外，还有四倍体的泥鳅和三倍体的花鳟鱼、鲫鱼等。开展鱼类自然多倍体的研究，对查明我国多倍体鱼类资源及合理开发利用这些资源具有十分重要的意义。
从来源上分析，如果加倍的染色体来自于同一物种或在原有染色体组的基础上加倍而成，则称为同源多倍体（homologous polyploid）（图1-1），如虹鳟鱼的受精卵用温度休克处理抑制第一次有丝分裂进而获得虹鳟鱼同源四倍体，其子代的染色体完全来源于同一物种虹鳟。如果加倍的染色体来源于不同的物种，则称为异源多倍体（heterologous polyploid）（图1-1），如用白鲫（2n=100）为母本，红鲤（2n=100）为父本进行属间杂交，受精卵再经温度休克处理抑制第一次有丝分裂使染色体加倍，结果获得四倍体鲤鲫杂种鱼苗（4n=200），其中父母本的染色体各占一半。
注：直线表示杂交；粗箭头表示染色体加倍；A、B代表染色体组
图1-1同源与异源四倍体形成过程
12鱼类自然多倍体形成机制
121体细胞染色体加倍
体细胞在有丝分裂中期发生分裂异常现象（核内有丝分裂、核内复制或分裂后两个子细胞的融合）导致染色体加倍分裂失败，形成染色体数目加倍的多倍体细胞，进而形成一定的多倍体组织或器官。所谓核内有丝分裂（endomitosis），是体细胞在正常有丝分裂中，染色体复制一次，但至分裂中期，核膜没有破裂、消失，也无纺锤丝的形成，当然也不会发生细胞分裂中后期的细胞质分裂，因此每个染色体形成四条染色体，称为双倍染色体（diplochromosome），这时染色体两两平行排列在一起，结果形成的细胞是四倍体。其后经过正常的细胞分裂，形成两个子细胞均为四倍体。这一过程发生在受精卵的第一次有丝分裂，即形成四倍体个体，若发生在性腺细胞则产生二倍体的配子，与二倍体交配则产生三倍体。日本北海道女满别街存在高频率的三倍体，经细胞遗传学研究三倍体是由同一栖息场所的二倍体泥鳅产生二倍体未减数卵与精子偶尔受精形成的，这些未减数的二倍体卵，精子不参与通过雌核发育进行繁殖。因此，把这种二倍体称为无性生殖二倍体，经细胞学研究表明，无性生殖二倍体的未减数卵的细胞学机制是减数分裂前核内有丝分裂，其原理如附图1-1所示。这种多倍体的组织或器官在动物和植物都可能出现，但动物和植物体上的发育结果是有明显差别的。动物体细胞染色体加倍后一般体细胞不能进行无性生殖而传留，只有当染色体加倍的细胞是生殖细胞时，这种变异才有可能传留，而且要求这一变异的个体恰好遇到了发生同一变异的异性，并有机会交配生殖才能有可能传留后代；同时，多倍体的动物因为生殖生物学方面的原因会遇到不育或育性不良的现象，因此动物多倍体传留后代的机会很少。
122生殖细胞的异常减数分裂
由于某种原因生殖细胞的同源染色体或姐妹染色单体在后期没有分开，二组染色体进入到同一配子中，导致配子中染色体数目的加倍形成2n配子。这样的配子经授精后形成倍性不同于亲代的多倍体，如三倍体、四倍体等，但其子代的可育性很低。从现有对多倍体细胞减数分裂研究结果看，奇数性动物多倍体中能形成的平衡配子的数目都极少。同源三倍体在减数分裂的后期，无论配成是一个双价体和一个单价体，还是配成一个三价体，平衡配子的类型只有二种，一种是n条染色体的配子,另一种是2n条染色体的配子，这两种类型的配子都是可育配子（平衡配子）。当所有的染色体都是每一条都进入同一极，则形成具有n条染色体的配子，其概率为（1/2）的n 次方，同时另一极则具有2n条染色体，也是可育配子，即同时产生2个可育配子，因此由（1/2）的n次方乘以2，这样就等于（1/2）的n-1次方（刘祖洞，1990），如3n的个体，只有（1/2）n-1个平衡配子。高等动物中，虽然雄配子一次产生的数量较多，但雌性个体一次产生的雌配子数目较少，因此，高等动物中能够形成平衡多倍体子代的可能性当然也就极小，实际存在的多倍体种类也就比较少（叶名文，1998）。
123双（多）精受精
在一些鱼类中是精子产生雄配子素Ⅱ，溶解卵膜孔的卵膜形成受精孔。卵子的卵膜孔区有两种雌配子素，雌配子素Ⅰ有吸引和加速精子活动的作用，一个精子进入卵子以后立即释放雌配子素Ⅱ，雌配子素II封闭卵膜孔，并有破坏被吸引到卵的表面而不能进入卵的精子的作用。因此，动物的受精机制保证只有一个精子进入卵子受精（叶富良，2002）。由于雌、雄配子素的共同作用，最终使1个精子的头部由卵膜孔入卵，实现精卵两核的融合。当卵子的受精孔由于某些生理的或自然的原因不能及时封闭时，则可能有两个或多个精子进入卵子，并同时完成受精过程，进而形成三倍体（双精）、四倍体（三精）的合子而发育形成多倍体个体。这种双精入卵的生物学现象在植物中、动物中，以及高等动物中均有发现。在自然界中靠自然力量形成多倍体的机制，目前还没有通过该种方法人工诱导多倍体的先例。
124远缘杂交
不同二倍体物种之间杂交，当杂交的两个物种血缘关系较远，会产生杂交种不育现象；当血缘关系比较近时形成异缘二倍体杂交种，如鲤鱼和鲫鱼杂交得到的大鳞鲤是异源二倍体；如果遗传基础差异较大，杂交很难获得二倍体杂种，但有时远缘杂交可以导致远缘多倍体的形成，这一现象在鱼类等水产动物的远缘杂交中经常出现，尤其是附以一定的技术手段处理后更加容易获得异源多倍体。
125个体发育调节机制
动物体中，染色体、神经、体液调节的存在，对配子的产生、合子的形成、性别的决定和子代个体的发育有重要影响。多倍体动物之所以稀少，可能与染色体的性别决定有关。任何多于二倍体的染色体都容易造成动物的高度不育。如XY型性别决定中，当染色体加倍时，一个雄性二倍体加倍而成的四倍体，其性细胞的染色体组成为XXYY，产生的配子所含性染色体为XY，一个雌的二倍体加倍形成的四倍体，其性细胞的染色体组成为XXXX，产生的配子所含性染色体为XX。这两种配子受精，形成XXXY合子，既不是完全的雌性，也不是完全的雄性，因而是不育的。
13鱼类多倍体诱导
131人工诱导多倍体的原理
根据鱼类受精细胞学的研究，鱼类成熟卵处在第二次减数分裂中期，精子入卵受精后放出第二极体。按照生殖细胞发生和细胞分裂的机制，鱼类多倍体诱导原理如下。
1311抑制第二极体的释放
鱼类雌性配子发生中，经过染色体的加倍以后第一次减数分裂正常进行，含有二套染色体的第一极体照常排出，初级卵母细胞形成次级卵母细胞。然后继续进行第二次减数分裂，但停留在中期。此时受精刺激其继续进行分裂排出第二极体（含有一套染色体），形成具有一套染色体的卵原核。与正常的雄性原核（精子）结合形成正常的二倍体（附图1-2A）。如果在第二极体释放前，由于某些物理的或者化学的因素可以使第二极体的排出受阻，致使第二极体不能排出而与卵原核融合形成二倍体的卵原核。如果第二次减数分裂仅进行到中期即行结束，实际等于第二次减数分裂没有发生，也形成二倍体的雌性原核。由第二极体排出受阻而形成二倍体的雌性原核与正常的雄性原核（精子）结合形成三倍体个体（附图1-2B）。
通过第二极体受阻形成的三倍体称为减分II型三倍体（MII，meiosis II）。通过抑制第二极体排出诱导多倍体（三倍体）是较为成型的技术，被广泛的应用于多种水产动物的三倍体诱导之中，其中有许多企业已经利用此项技术进行商业化生产三倍体苗种。
1312抑制第一次卵裂
卵子和精子正常的结合形成正常的二倍体合子。合子形成以后很快进入卵裂期发生第一次卵裂。只要能在第一卵裂期间阻止纺锤丝的形成，使卵细胞的第一次有丝分裂成为核内有丝分裂，其结果是染色体复制，一个细胞内含双倍的二倍体染色体，由此发育为一个个体即为四倍体（附图1-2C）。抑制第一次卵裂的发生是目前诱导水产动物四倍体最为经济有效的方法。
14人工诱导多倍体产生的方法
多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，可以通过多种方法（因子）抑制极体的释放产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体。目前广泛应用的诱导方法有物理学、化学和生物学三种。
141物理学方法
受精卵的物理学处理方法已被广泛地用来抑制第二次减数分裂生产三倍体或第一次卵裂生产四倍体。主要包括温度休克、静水压力处理与电休克法等。
1411温度休克法
该方法是以改变环境温度来阻止卵母细胞正常分裂而产生多倍体。其原理是通过高温或低温温度短时间内休克（shock）细胞，使细胞中的纺锤丝被破坏。其最大的特点就是廉价、易操作，是诱导水产动物多倍体的常用手段，也适合大规模生产使用。根据处理温度的高低分为冷休克法（Cold shock）和热休克法（Heat shock）。即用略高于或低于致死温度的冷或热冲击来诱导多倍体。
（1）冷休克法。
其原理是低温能够阻止微管蛋白聚合成微管，从而阻止纺锤丝形成；纺锤丝被破坏以后则细胞不能正常分裂，极体不能形成并不能排出卵细胞。这一过程通常称为抑制极体的排放，由此可获得二倍体的卵核，将其与单倍体的精子受精即可获得三倍体。温度休克可以在第一次减数分裂期间（目前的技术只适用于某些无脊椎动物）进行（抑制第一极体的排出），也可以在第二次减数分裂中进行（抑制第二次减数分裂）。无论抑制哪一个极体的排出，均需要准确的处理时间，也就是减数分裂的中期，纺锤丝形成前和形成期间进行温度处理才能保证效果。如果诱导休克发生在第一次卵裂，则抑制了第一次卵裂的分裂过程，使卵细胞发生核内有丝分裂形成四倍体。
（2）热休克法。
若细胞处于较高温度环境中，或高温对细胞发生冲击，细胞内一些进行生命活动的重要酶类如ATP酶就会遭到破坏，从而使供能途径受阻，纺锤体不能形成，进而抑制了细胞的分裂。当将适宜的温度处理正在进行减数分裂的卵细胞时，纺锤体的破坏导致细胞分裂失败，极体不能排放，形成二倍体的卵原核，与正常精子受精即形成多倍体。热休克处理的时间与冷休克一致，即处理的时间必须刚好在减数分裂的中期以前及中期分裂纺锤丝形成期间，对于贝类可以是第一次减数分裂，也可以是第二次减数分裂；但对于鱼类目前仅对第二次减数分裂有效。如果诱导休克发生在第一次卵裂，则抑制了第一次卵裂的分裂过程，使卵细胞发生核内有丝分裂形成四倍体。
处理的温度同样因种类而异，喜冷性鱼类如鲑科鱼类宜用热休克，温度范围以不致死鱼卵或少量致死为度，多为28～36℃。而温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0～8℃，但最近研究表明，鲤鱼用热休克同样可以获得较高比例的三倍体。进行温度处理最重要的是必须确定处理的开始时间、持续时间，以及温度高低。
1412静水压处理
在天然水体中，水产动物尤其是鱼类产卵后，水位的突然变化（水深加大），导致卵所处环境的压力增大，这种静水压力适宜时，鱼卵减数分裂的纺锤丝会因压力的作用而裂解，导致二倍体卵子的形成，进而与正常精子受精得到三倍体。水压力的变化发生在第一次卵裂时，由于破坏了二倍体体细胞的纺锤丝的形成，导致类似于核内有丝分裂的现象发生则可能产生四倍体的个体。受此启发，将鱼卵采用较高的水静压处理（大约为650kg/cm2）来诱导多倍体简单易行。其原理是当细胞处于高压情况下微管所保持的结构失去原有的空间构型和刚性，微管发生可逆性裂解，破坏纺锤丝的形成，从而破坏了细胞分裂，抑制了第二极体的排出，或破坏了中期板的形成导致核内有丝分裂，进而诱导出多倍体。例如，欧洲鲶鱼受精后3min以600kg/cm2的静水压力处理鱼卵4min，结果得到978%三倍体胚胎，最后有337%的存活率；皱纹盘鲍的受精卵在受精后7min或22min分别施加650～750kg/cm2处理5min，诱发得到60%的三倍体。
静水压力处理方法的特点是诱导率较高（可达90%～100%）、处理时间短、受精卵损伤小、成活率高，但需要专门的设备—静水压力容器（图1-2），小批量生产成本较高。商业生产中多制造较大型的静水压力容器，既可保证诱导的质量，又可以批量生产，降低生产成本。目前已经商业化生产多倍体苗种的企业多数采用静水压力容器诱导方法。
图1-2静水压机
1413电脉冲休克
在一定的电场条件下，细胞与细胞之间的膜会发生融合，导致两个细胞合二为一，从而诱发多倍体（四倍体）。例如：将银大麻哈鱼受精40min后的卵置于26℃并给以10min的交流电脉冲休克处理可得到100%的三倍体。
142化学方法
一些化学物质可以破坏细胞分裂中纺锤体的形成，进而阻止卵细胞极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生多倍体。
1421秋水仙素（Colchicine，分子式：C22H25NO6·12H2O）
秋水仙素是从百合科植物秋水仙的种子、鳞茎中提取的生物碱。它能抑制微管的组装，使已有的微管解聚合，阻止纺锤体的形成或破坏已形成的纺锤体，从而导致核内有丝分裂形成多倍体细胞。在去除秋水仙素后，其作用立即结束，细胞恢复正常的生理状态。该种诱导剂在植物育种中的应用较为广泛，且有许多成功的例子。在水产动物中或其他动物中的应用较少。
1422细胞松弛素B（Cytochalasin B，分子式：C29H37NO5，简称CB）
细胞松弛素B是真菌的一类代谢产物，是水产动物育种中最常用的一种化学诱导药物。细胞松弛素B处理细胞可诱发一系列细胞学效应，如细胞骨架的变化、多核化、破坏微丝等。一般认为细胞松弛素B特异性破坏微丝，最终导致控制细胞分裂的由微丝构成的收缩环的解体，抑制细胞质分裂，阻止极体的释放，从而产生多倍体。细胞松弛素B是一种致癌物质，水溶性较差。一般用细胞松弛素B处理受精卵，将其溶解在1％的二甲基亚砜（DMSO）中配制成一定浓度的药液，处理结束后需用含1% DMSO的溶液浸洗受精卵，去除残留的细胞松弛素B。
1423聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）
聚乙二醇是一种常用的细胞融合剂，能使细胞发生融合作用，从而使染色体加倍。该药物被广泛的应用于试管内的细胞融合，如单克隆抗体的制备等方面。由于其特殊的理化特性，也将其应用于水产动物的多倍体诱导。Ueda等（1986）用聚乙二醇处理虹鳟精子，然后授精，获得了2/5的三倍体胚胎，经染色体核型分析，两套染色体来自父本，一套来自母本。证明三倍体的形成是由融合的双精子授精所致。
14246-二甲基氨基嘌呤（6-Dimethylaminopurine，分子式：C7H9N5，简称：6-DMAP）
6-二甲基氨基嘌呤是嘌呤霉素的一种类似物，其生理作用是抑制蛋白质磷酸化，通过作用于特定的酶，破坏微管的的聚合中心，使微管不能形成，从而破坏细胞分裂，抑制卵细胞极体的形成和释放。6-DMAP非致癌性，具水活性。洗除该药物后，受精卵可以正常发育。6-DMAP低毒、高效、价格便宜，在诱导多倍体方面表现出较大的优越性和较广阔的应用前景。
1425咖啡因（Caffeine）
咖啡因是一种生物碱，化学名为1，3，7-黄嘌呤，又称三丙黄嘌呤。它无色无味，存在于多种植物之中。咖啡因进入细胞后可以立即提高细胞内的Ca2+浓度，由于微管对Ca2+浓度敏感，当Ca2+浓度极低或高于10-3时，会引起微管二聚体的解聚，阻止细胞分裂，从而形成多倍体。
143生物学方法
远缘杂交、核移植及细胞融合是采用生物方法诱导鱼类多倍体的有效途径。
1431远缘杂交
在许多情况下，血缘比较远的物种之间是不能雌雄配子杂交产生后代的，有些虽然可以成功的杂交但杂种后代不育，这是因为物种间遗传基础的差异导致的。例如马和驴杂交，其后代为骡子，是严重不育的典型。杂交失败主要是配子之间不亲和性以及染色体之间配对的失衡导致的，亲本配子染色体加倍可以使染色体达到平衡，从而克服远缘杂交的困难获得多倍体的杂交种，因此，远缘杂交可以产生异源多倍体（Heterologous polyploid）。远缘杂交产生多倍体多为三倍体，但也有产生四倍体的报道。吴维新等（1988）在草鱼和红鲤的远源杂交组合中获得了数尾自然加倍的异源四倍体鱼，但是由于后代性状分化严重，在生产上没有应用价值。刘筠等（1986）自20世纪70年代以来，在鲤科鱼类的属间和不同亚科之间的远源杂交中分别获得为数众多的三倍体鱼和四倍体鱼群体。其中，在湘江野鲤（♂）× 红鲫（♀）获得F1 中发现部分可育的二倍体个体，自交获得了F2；在F2 自交后所得的第三代（F3）中发现有四倍体个体即异源四倍体鲫鲤。异源四倍体鲫鲤雌雄两性可育，遗传性状稳定，已形成了一个染色体数目为4n=200的新种。刘少军等（2007）在团头鲂（♂）× 红鲫（♀）F1 中获得了四倍体鲫鲂，四倍体鲫鲂（Ⅱ龄）达到性成熟，且雌雄两性可育。
1432核移植及细胞融合
核移植诱导鱼类多倍体技术仍处于实验阶段，试管内的细胞融合可以产生多倍体细胞，陆仁后等（1982）用四倍体的草鱼培养细胞的细胞核作为供体移植到泥鳅的去核卵内，获得心跳期的四倍体胚胎。该技术的成熟，很可能成为诱导四倍体鱼类的有效途径之一。活体体细胞之间的融合能直接产生多倍体个体，可以通过电脉冲等来实现，主要诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或者受精卵与受精卵之间的细胞融合。易泳兰等（1988）将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育得到了35%的融合鱼苗。
前面已经叙述体外用人工方法将两个精子融合后授精得到三倍体后代，人工注射两个精子代替自然受精过程也是一个生产多倍体的途径。
1433四倍体与二倍体杂交生产三倍体
目前对三倍体诱导的大量工作表明：很难有一种方法能100%的产生三倍体，且操作烦琐，每年进行诱导培育，使用昂贵的仪器，所用药品毒性大、价格昂贵，生产成本较高。四倍体与正常二倍体杂交，从理论上讲可以产生100%不育的三倍体（图1-3），从而实现大量、安全、方便、可靠的生产三倍体。该方法具有可操作性、连续性和经济性等方面的优势，是实现三倍体产业化的理想途径。这一方法首先需要获得四倍体，由于阻止第一次卵裂较阻止极体的排出难得多，因而获得四倍体的难度相对要较诱导生产三倍体大得多。目前仅在鱼类中获得了有价值的四倍体，例如虹鳟受精卵用CB处理，以及用热休克和静水压处理都获得了四倍体，用四倍体已经可以商业化生产虹鳟三倍体苗种。刘筠等用鲫和鲤交杂获得四倍体鲫鲤，然后将其与鲤鱼或鲫鱼回交获得了三倍体的杂种，分别称为湘云鲤和湘云鲫。另外已经获得奥利亚罗非鱼的四倍体个体，兴国红鲤与草鱼异源四倍体，鲢鱼的四倍体。李雅娟等（2010）利用自然四倍体泥鳅与二倍体杂交生产了杂交三倍体泥鳅。
通过四倍体与二倍体的交配生产三倍体时，多用四倍体作母本，二倍体作父本。这是因为可以保证较高的受精率。如果将四倍体作父本，则因为精子的头部较大，二倍体的卵子的受精孔较小导致受精率低下。
图1-3四倍体雌鱼与二倍体雄鱼杂交培育三倍体
15多倍体的鉴定
由于经人工处理的受精卵不能保证百分之百地成为多倍体，而且所形成的多倍体常常表现为嵌合体，因此进行染色体倍性鉴定对于确认诱导效果就显得十分必要。鉴定方法分为直接和间接两种方法。直接方法包括染色体计数和DNA含量测定等，间接方法包括细胞测量、蛋白质电泳、生化分析和形态学检查。现将常用的鉴定方法介绍如下。
151染色体计数法
通过制备染色体玻片标本后直接计数细胞中的染色体数并与正常二倍体相对照进而确定倍性的方法，是鉴定倍性最直接可靠的方法。
1511肾脏组织染色体制片法（以德国镜鲤为例）
（1）PHA和秋水仙素处理。
每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液，剂量为12μg/g（鱼/体重），18～20h后第二次注射同样剂量PHA，作用4～6h后，活体腹腔注射01%秋水仙素，溶液剂量为6μg/g（鱼体重），效应时间2～3h。
（2）取材与低渗。
配制2～4mg/kg的麻醉剂将鱼麻醉，剪尾鳍放血5～10min，取头肾剪碎于淡水生理盐水中，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，加入08%的柠檬酸三钠溶液低渗40～45min。
（3）固定。
低渗结束后，离心5min（1 000r／min）。弃上清液，放入甲醇冰醋酸=91的固定液中固定7～10min，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，转入100%冰醋酸中处理1～2min，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，再将肾组织块移入新配制预冷的卡诺固定液（甲醇冰醋酸=31）中，每隔15min更换一次固定液，重复3次，固定完毕放入青霉素小瓶中，加入新的固定液，用封口膜封口放入冰箱冷冻过夜。
（4）制片。
将固定过的样品取少量组织块于5ml小烧杯中，加入2～3滴50%冰醋酸，将组织制成细胞悬液后，加少量新配制的固定液，过滤后进行冷滴片法滴片过火，看到玻片上燃烧蓝色火焰即可。室温自然干燥。
（5）染色和镜检。
完全干燥的染色体玻片用体积分数为10%的Giemsa（pH＝68）染色液染色1～2h，蒸馏水冲洗，自然干燥。利用显微镜进行观察拍照（附图1-3）。
1512鱼类鳃细胞染色体标本制备
（1）PHA和秋水仙素处理。
用2～4mg/kg苯甲醇麻醉鱼，称重。每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液,剂量为6μg/g（鱼体重），18～20h后第二次注射同样剂量PHA，作用4～6h后，活体腹腔注射01%秋水仙素溶液，剂量为6μg/g（鱼体重），效应时间2～3h。
（2）取材。
用2～4mg/kg苯甲醇麻醉鱼，剪尾鳍放血5～10min。取鳃放入装有淡水生理盐水中的小烧杯中，不剪碎。
（3）低渗。
加入2ml 8‰的柠檬酸溶液室温下低渗40～45min。
（4）固定。
低渗后放入甲醇冰醋酸=91的固定液中固定7～10min，再转入100%冰醋酸中处理1～2min，再在常规甲醇冰醋酸=31的固定液中固定2～3次，每次15min，完毕后放入冰箱冷冻过夜。
（5）滴片。
将固定过的样品吸去固定液，加入1～2滴50%冰醋酸，用镊子将鳃丝轻轻抖动，用手术剪将鳃剪碎，制成细胞悬液后，加少量新配制的固定液，用筛绢网过滤。取预冷湿玻片一张用吸管吸取过滤后的细胞悬液，从30cm左右的高度滴到载玻片上，用口吹散滴液，置于酒精灯上过火，看到玻片上燃烧蓝色火焰即可，最后摆放到解剖盘中室温下自然风干。
（6）染色。
完全干燥的染色体玻片用pH值为74的磷酸缓冲液配制的体积分数为10%的Giemsa染色液染色1～2h，自来水冲洗，自然风干。
（7）镜检，拍照。
先在低倍镜下观察，选择染色体形态良好、分散适中的中期分裂相，然后换油镜拍照。四倍体泥鳅鳃细胞染色体相参见附图1-4。
1513胚胎细胞染色体标本制备
取发育至肌肉效应期的红鳍东方鲀的受精卵各40个，分别放入铺有琼脂糖的培养皿中，加入适量生理盐水，在解剖镜下用钟表镊子剥去卵膜、卵黄，00025%秋水仙素浸泡45min，08%柠檬酸低渗15～20min，用预冷的卡诺固定液（甲醇冰醋酸=31）重复固定3次，每次15min，冷冻（-20℃）过夜。次日吸出一个胚胎到4孔载玻片上，滴1～2滴50%冰醋酸，用黄枪头捣碎呈细胞悬液，再加入一滴预冷的卡诺固定液，用枪头混匀，吸出所有液体，进行冷滴片，过火，风干，10%吉姆萨染色30min后冲洗，风干，镜检，拍照（附图1-5）。
152核仁银染法（Ag-NORs）
细胞的核仁数目与倍性有关，在正常情况下，单倍体细胞含一个核仁，二、三、四倍体细胞分别含二、三、四个核仁。在多倍体鱼类的倍性鉴定中，银染核仁组织区法与其他多倍体鱼类的倍性检测方法相比，不但快捷准确而且省时省力，无须特殊的仪器,在条件相当简陋的实验室就可以进行操作，是值得推广的一种好方法。
具体操作方法主要参照Howell and Black（1980）的快速银染法并略加修改。50%AgNO3与明胶溶液21在染色体片子上混合，加盖玻片，70℃恒温箱中处理2～3min，用70℃去离子水冲洗，自然干燥；干燥后显微镜下观察，拍照（图1-4）。
图1-4德国镜鲤间期细胞核Ag-NORs 标尺示10μm
153细胞核体积测量法
同一研究对象的二倍体和多倍体个体，其细胞核及细胞大小不同。二倍体与三倍体、四倍体血红细胞核体积预期比值为1152。
红细胞测量的具体操作简单。以泥鳅为例（附图1-6）。
（1）血涂片的制备。麻醉鱼采用一次性注射器从实验鱼尾部静脉处采血，涂片后用甲醇固定3～5min，吉姆萨染液染色5min。
（2）镜检拍照。先用低倍镜下观察，找到细胞分散均匀、不重叠、不变形的视野，换高倍镜观察后用数码显微拍照。并在同样倍数下拍台微尺。
（3）用Adobe Photoshop软件测量。计算核体积=4/3πab2或=ab2/191，式中a—为长半轴，b—为短半轴。
154极体计数法
极体计数法已作为一种简单快速的方法用于早期胚胎三倍体的检测（Beaumont等，1986）。观察鱼类极体释放的具体方法是将受精卵用波恩固定液固定后，用刀片将卵黄切除，依常规方法脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，染色（一种是用DAPI染色，另一种是苏木精，曙红双重染色）以后步骤与正常的组织切片相同（附图1-7）。
155DNA含量测定方法
细胞核内的DNA含量与它们所含的染色体数成比例，当细胞内染色体倍数增加时，其DNA含量也相应增加，所以可以通过DNA含量来确定染色体数目的多少。
1551流式细胞仪
用流式细胞仪测定细胞DNA含量具体方法（以泥鳅为例）。
（1）机械法。剪取约5mm×5mm大小的尾鳍,放置于干净的小培养皿中,用刀片将尾鳍剁碎；将剁碎的样品转入样品管中,加入DAPI染液,用SK-1快速混匀仪振荡10～15s,使细胞脱落游离；用300～500目小筛网过滤混悬液到测试小管中,制得细胞悬液,使样品管液体体积最终在15～2ml,样品细胞的最终浓度为105～106个/ml。
（2）抽取血液法。用经肝素润湿的一次性注射器在尾静脉抽血002～003ml，注入加有1ml淡水生理盐水的离心管中，轻轻摇动使血液混匀；用滴管抽取血液混合液一滴到测试小管中，加入10～15mlDAPI染液,上机进行测试。检测结果以DNA直方图的形式表示，图中横坐标代表DNA的相对含量，纵坐标代表细胞频率。从图中可看出三倍体泥鳅的DNA含量是二倍体泥鳅DNA含量的15倍；四倍体泥鳅的DNA含量是二倍体泥鳅DNA含量的2倍（图1-5）。
A:二倍体；B：三倍体；C：四倍体
图1-5泥鳅流式细胞仪倍性检测结果
1552显微荧光测定法
将被测材料用固定液固定后，将组织用细胞匀浆仪弄碎，使细胞游离制成涂片标本，或者采取血液制成血涂片固定。标本用DAPI染色，然后在显微分光光度计，通过365nm长的紫外线，用扫描测光装置测定细胞核的荧光强度，获得处理组个体和对照组个体之间细胞核DNA相对含量曲线，从而测出二者的DNA比率，即可确定处理组个体的倍性，进而计算出三倍体的诱发率。
16多倍体的生物学特性
161性腺发育
人工诱导的三倍体鱼类预期是不育的，因为奇数染色体组将导致减数分裂姊妹染色体配对的不平衡而不能进行，由此引发性腺发育的受阻或非整倍体配子的产生，已有许多研究证明了这一点。如诱发尼罗罗非鱼三倍体雌雄皆为不育；三倍体草鱼和三角鲂杂种的雌性完全不育，雄性个体的生殖细胞只能发育到精原细胞阶段，也为不育；三倍体的鲤鱼性腺不能发育；黑鲷三倍体性腺明显小于二倍体，即使2～4龄的性腺能产生精子但其形态异常且浓度较低。一般三倍体雄鱼比三倍体雌鱼呈现较好的性腺发育。
四倍体个体的性腺发育正常，但育性较二倍体表现差。李建中等（2002）采用组织切片技术对异源四倍体鲫鲤的性腺进行研究，结果表明，异源四倍体鲫鲤的性腺发育是正常的，雌雄个体都能达到性成熟。两性可育并遗传稳定的四倍体鱼为探讨自然界鱼类多倍体形成机制提供了重要的理论依据，为鱼类多倍体育种提供了新的途径。
162生活力与生长
大多数学者的研究发现，人工诱导的三倍体鱼类具有正常的生活力。如三棘刺鱼、鲽与川鲽杂种、奥利亚罗非鱼、鲤、草鱼以及斑马鱼等的生活力与同种的二倍体没有明显的区别。但也有例外，如虹鳟和银大麻哈鱼等人工诱导三倍体的生活力比二倍体差一些。
在早期生长上，有的三倍体鱼要比二倍体快。吴清江等（1979）用红鲤×镜鲤得到的三倍体孵出的8个月内体重比二倍体重26～263倍。三倍体奥利亚罗非鱼14周时，其个体比二倍体鱼个体大。但更多的研究表明三倍体和二倍体两者在早期生长方面无明显差异。还有例子表明三倍体鱼的生长低于二倍体。
163其他性状
经过对鱼肉质量、含氧量、抗病性和感觉特性等性状的研究发现三倍体虹鳟的鱼肉质量优于二倍体；三倍体大西洋鲑需氧能力低于二倍体，故可适于低氧环境养殖；三倍体香鱼的抗病力与二倍体无明显差异。
多数情况下三倍体的个体不比二倍体大，这必然伴随三倍体个体细胞数量的减少，同时也伴随各个器官细胞数量的减少。脑细胞数量的减少导致三倍体的智力可能比二倍体低下，这有可能使三倍体的竞争力较低。同样分泌器官细胞数量的减少也可能使调节免疫力等的物质的分泌量减少，如激素等。
17多倍体的应用
171提高生长速度
由于三倍体不需要消耗能量用于生殖腺发育，可将所有的能量用于生长，故三倍体的生长速度在性成熟期间及以后会具有生长优势。从水产养殖角度出发，人工诱导三倍体的兴趣多半是寄希望于三倍体会比二倍体生长得更快，其生长情况因种类和发育阶段而异。研究发现，在性成熟时，三倍体普遍比二倍体生长快。三倍体鱼早期生长与二倍体相比没有什么优势，但到了产卵期，其生长速度明显快。生物的生长往往在性成熟以后会停滞或大幅度的减慢，有人期望三倍体因性腺不发育，因此也就不会停止身体的生长，这样养殖生产即可以获得较大个体的养殖对象，例如，期望大麻哈等鱼类的三倍体可以生长到金枪鱼那样大小。
172控制过度繁殖
三倍体鱼类的性腺不发育，所以不会产生后代，这为三倍体的生物学利用提供了广泛的空间。可以用养殖不育的群体控制养殖密度，例如罗非鱼的繁殖能力较强，且一年数次产卵，导致养殖水体中数代同塘，个体大小非常不匀，放养三倍体则不会产生此类问题。用三倍体群体完成一些短期的目标，目标完成以后群体也自然消亡，如在杂草丛生的水体放养不育的草鱼三倍体既能除草又可防止因其繁育后代导致的生态变化。此项技术在鲍鱼、珍珠贝上效果也特别明显。
173延长寿命
对于那些在性成熟时会遭受损失或有成熟死亡的鱼类来说，不育三倍体可能比二倍体存活得更长久。在鲑鳟鱼类中如虹鳟在缺乏产卵支流的湖泊中会有很高的死亡率，又如大麻哈鱼等降海的鲑科鱼类一生产卵一次，产卵后通常死亡（成熟死亡），而三倍体大麻哈鱼就不存在这种情况，它的性腺不发育，因此就不会性成熟，也就不会因性成熟而发生成熟死亡。香鱼和公鱼的寿命很短，一般是在秋季产卵繁殖，而后结束其一生，而三倍体香鱼可以跨年生长，还可以全年上市销售。
174改善品质
三倍体物种的细胞体积大，因此同样大小的二倍体和三倍体，三倍体的细胞数量要少于二倍体，相对的筋膜等也少于二倍体，并且三倍体的鱼肉看起来较有光泽，因此三倍体个体的肌肉的口感柔软，更受消费者的偏爱。Wolters等（1982）认为，三倍体斑点叉尾具有比二倍体小的头部，这样净肉率高于二倍体，在加工过程中浪费较少。三倍体香鱼的鱼片厚度平均比二倍体高；三倍体和二倍体鲽与川鲽杂种也有同样情况。
性成熟的动物往往伴随着肌肉质量的下降，动物生产中采取阉割的办法避免肌肉质量下降。对于那些无法采用阉割技术的动物，则在性成熟前上市保证肌肉的品质。所以欧美国家消费虹鳟等鱼类时，偏好个体较小的未成熟个体。三倍体的鱼类因性腺不发育，生长中没有肌肉质量下降的问题。
18多倍体泥鳅研究现状
泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是广泛分布在中国大陆、朝鲜半岛、日本列岛、台湾等地的鲤形目、鳅科、泥鳅属的小型淡水鱼类（斉藤憲治，1989）。泥鳅肉质鲜美，营养丰富，富含蛋白质及多种维生素，并具有药用价值，被誉为“水中人参”（刘孝华，2008）。泥鳅具有广阔的市场前景（谷士荣，2011），在我国南北各地，泥鳅作为滋补佳品早已摆上家庭、酒店的餐桌，日本和韩国人视其为高档营养食品，更是畅销不已。据国内外泥鳅市场调查显示，从2001年至今，连续走俏市场。价格连年攀升。但由于多年的过度捕捞，自然水域生态环境日益恶化，我国野生泥鳅的产量正逐渐降低，泥鳅已经成为我国目前主要的养殖品种。随着养殖规模的逐渐扩大，高产、高效的优良品种已成为泥鳅养殖业发展的瓶颈之一。三倍体鱼类以其育性差、生长快等特性而成为鱼类遗传育种研究的热点。因此，规模化培育三倍体泥鳅，对促进泥鳅养殖生产的发展，将具有重要的经济价值和广阔的应用前景。
泥鳅的倍性一直受国内外学者所关注。国外主要集中在日本，1979年，日本学者Ojima和Takai（1979）首次在野生群体的泥鳅样本中发现染色体数为2n=50的二倍体、3n=75的三倍体和来自水产品市场的（来源不明）4n=100的四倍体个体。Arai研究室历经20多年对日本产自然三倍体及起源不明的四倍体（来源市场）进行了系统的研究。发现日本除正常有性生殖的二倍体泥鳅外，还存在无性生殖二倍体和杂种生殖的三倍体，但没有发现自然四倍体（Morishima K et al.，2002；Arai K et al.，1991；Zhang Q et al.，1999；荒井克俊，2004）。日本产三倍体是由于同一栖息场所的二倍体泥鳅产生二倍体未减数卵与精子偶尔受精形成的，这些未减数的二倍体卵，精子不参与通过雌核发育进行繁殖。因此，把这种二倍体称为无性生殖二倍体，经细胞学研究表明，无性生殖二倍体的未减数卵的细胞学机制是减数分裂前核内有丝分裂（荒井克俊，2004）。并通过线粒体DNA序列及微卫星分析进一步证明了日本泥鳅分为两个不同的种类，无性生殖二倍体是由两个不同种间泥鳅杂交形成的（Kagayaki Morishima et al.，2008）。通常人工诱导的三倍体无论雌雄都不育，而日本产自然三倍体雄的不育，雌的可以产生单倍体（1n）和三倍体（3n）卵。并证实了起源不明的四倍体是遗传的四倍体（2n=100），同时利用起源不明的四倍体通过人工繁殖实验及染色体操作培育出三倍体、四倍体、五倍体及六倍体，并对其后代的染色体数目、成活率等生殖特性进行了详细的研究（荒井克俊，2009）。
我国关于自然多倍体泥鳅的研究以往报道较少。主要集中在四倍体核型（李康等，1983；李渝成等，1987；印杰等，2005）、倍性鉴定（李雅娟等，2008；高泽霞等，2007；郭伟荣等，2009）、细胞色素b基因序列（Yang C et al.，2009）、群体遗传结构（周玲玲等，2011）、线粒体基因多态性（郑鹏飞等，2011）等研究上。本书著者从2004—2011年与日本北海道大学荒井克俊教授进行了合作研究。为探讨中国天然多倍体泥鳅的分布、起源及形成机制，对中国泥鳅线粒体DNA序列分析、自然多倍体的分布、体细胞染色体核型分析、染色体带型和FISH研究、减数分裂染色体行为、人工诱导雌核发育及生殖特性等方面进行了系统的研究。初次证实了我国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体(4n=100)、是同源四倍体、能产生正常的2n配子（雌或雄）。2012—2016年李雅娟主持的国家自然科学基金项目“泥鳅杂交三倍体染色体组稳定性及其表观遗传机制解析（31272650）”首次利用天然四倍体泥鳅与二倍体杂交制备了1种新型的杂交三倍体，并对早期的染色体数目、DNA含量、生殖特性、减数分裂行为、性腺发育及表观遗传机制等进行了研究。从表观遗传学的角度对杂交三倍体泥鳅及其亲本DNA甲基化水平差异和关键基因的甲基化调控机制进行分析，探索杂交三倍体优势性状的表观遗传机理。从而促进杂交三倍体泥鳅杂种优势的形成。为今后鱼类三倍体杂种优势形成机理提供理论与技术支持。为我国三倍体鱼类的产业化探索高效易行的新途径奠定基础。
第2章中国自然多倍体泥鳅的分布、染色体核型及形态特征
文摘
第1章绪论
11鱼类染色体的多倍性
一个物种细胞中染色体形态结构和数目的恒定性是这个种的重要特征。二倍体生物在有性繁殖过程中，或者是生物体世代交替中，能维持配子正常功能的、最低数目的一套染色体（chromosome set）称为染色体组或基因组（genome）。进行有性生殖的生物把含有2套染色体组的称为二倍体（diploid，2n），含有3套、4套染色体组的生物分别称为3倍体（triploid,3n）和4倍体（tetraploid,4n）。多倍体（Polyploid）最早是由德国学者Winkler（1916）诱发植物多倍体成功后首先提出来的。它是指生物体体细胞中含有3套或3套以上染色体组的个体。由于多倍体生物具有比二倍体多出一倍或以上的基因和复等位基因的变异，所以拥有更高的代谢能力和物质合成能力。多倍化是生物进化变异的自然现象，也是促进生物发生进化改变的重要力量。据不完全统计，植物界中被子植物有30％～80%是多倍体，大约70%显花植物在进化过程中进行多倍化。但动物中的多倍体现象比较少。在低等动物中，如甲壳类中的盐水丰年虾为四倍体；线形动物中的马蛔虫为同源四倍体（4n=4）。昆虫中的多倍体现象又总是与孤雌生殖方式联系在一起。在水产动物中，多倍体现象比较普遍。世界上现存鱼类约有2万多种，已研究过染色体的鱼类约有1 100余种，其中多倍体至少有60种（桂建芳，1985；马纲，1996）。许多多倍体种类是重要的经济鱼类或重要的养殖对象。例如鲑科的虹鳟、白鲑、各种大麻哈鱼和茴鱼是四倍体；胭脂鱼科中几乎所有的种类都是四倍体；鲫鱼的变种—金鱼中除了四倍体外，还有三倍体如银金鱼。此外，还有四倍体的泥鳅和三倍体的花鳟鱼、鲫鱼等。开展鱼类自然多倍体的研究，对查明我国多倍体鱼类资源及合理开发利用这些资源具有十分重要的意义。
从来源上分析，如果加倍的染色体来自于同一物种或在原有染色体组的基础上加倍而成，则称为同源多倍体（homologous polyploid）（图1-1），如虹鳟鱼的受精卵用温度休克处理抑制第一次有丝分裂进而获得虹鳟鱼同源四倍体，其子代的染色体完全来源于同一物种虹鳟。如果加倍的染色体来源于不同的物种，则称为异源多倍体（heterologous polyploid）（图1-1），如用白鲫（2n=100）为母本，红鲤（2n=100）为父本进行属间杂交，受精卵再经温度休克处理抑制第一次有丝分裂使染色体加倍，结果获得四倍体鲤鲫杂种鱼苗（4n=200），其中父母本的染色体各占一半。
注：直线表示杂交；粗箭头表示染色体加倍；A、B代表染色体组
图1-1同源与异源四倍体形成过程
12鱼类自然多倍体形成机制
121体细胞染色体加倍
体细胞在有丝分裂中期发生分裂异常现象（核内有丝分裂、核内复制或分裂后两个子细胞的融合）导致染色体加倍分裂失败，形成染色体数目加倍的多倍体细胞，进而形成一定的多倍体组织或器官。所谓核内有丝分裂（endomitosis），是体细胞在正常有丝分裂中，染色体复制一次，但至分裂中期，核膜没有破裂、消失，也无纺锤丝的形成，当然也不会发生细胞分裂中后期的细胞质分裂，因此每个染色体形成四条染色体，称为双倍染色体（diplochromosome），这时染色体两两平行排列在一起，结果形成的细胞是四倍体。其后经过正常的细胞分裂，形成两个子细胞均为四倍体。这一过程发生在受精卵的第一次有丝分裂，即形成四倍体个体，若发生在性腺细胞则产生二倍体的配子，与二倍体交配则产生三倍体。日本北海道女满别街存在高频率的三倍体，经细胞遗传学研究三倍体是由同一栖息场所的二倍体泥鳅产生二倍体未减数卵与精子偶尔受精形成的，这些未减数的二倍体卵，精子不参与通过雌核发育进行繁殖。因此，把这种二倍体称为无性生殖二倍体，经细胞学研究表明，无性生殖二倍体的未减数卵的细胞学机制是减数分裂前核内有丝分裂，其原理如附图1-1所示。这种多倍体的组织或器官在动物和植物都可能出现，但动物和植物体上的发育结果是有明显差别的。动物体细胞染色体加倍后一般体细胞不能进行无性生殖而传留，只有当染色体加倍的细胞是生殖细胞时，这种变异才有可能传留，而且要求这一变异的个体恰好遇到了发生同一变异的异性，并有机会交配生殖才能有可能传留后代；同时，多倍体的动物因为生殖生物学方面的原因会遇到不育或育性不良的现象，因此动物多倍体传留后代的机会很少。
122生殖细胞的异常减数分裂
由于某种原因生殖细胞的同源染色体或姐妹染色单体在后期没有分开，二组染色体进入到同一配子中，导致配子中染色体数目的加倍形成2n配子。这样的配子经授精后形成倍性不同于亲代的多倍体，如三倍体、四倍体等，但其子代的可育性很低。从现有对多倍体细胞减数分裂研究结果看，奇数性动物多倍体中能形成的平衡配子的数目都极少。同源三倍体在减数分裂的后期，无论配成是一个双价体和一个单价体，还是配成一个三价体，平衡配子的类型只有二种，一种是n条染色体的配子,另一种是2n条染色体的配子，这两种类型的配子都是可育配子（平衡配子）。当所有的染色体都是每一条都进入同一极，则形成具有n条染色体的配子，其概率为（1/2）的n 次方，同时另一极则具有2n条染色体，也是可育配子，即同时产生2个可育配子，因此由（1/2）的n次方乘以2，这样就等于（1/2）的n-1次方（刘祖洞，1990），如3n的个体，只有（1/2）n-1个平衡配子。高等动物中，虽然雄配子一次产生的数量较多，但雌性个体一次产生的雌配子数目较少，因此，高等动物中能够形成平衡多倍体子代的可能性当然也就极小，实际存在的多倍体种类也就比较少（叶名文，1998）。
123双（多）精受精
在一些鱼类中是精子产生雄配子素Ⅱ，溶解卵膜孔的卵膜形成受精孔。卵子的卵膜孔区有两种雌配子素，雌配子素Ⅰ有吸引和加速精子活动的作用，一个精子进入卵子以后立即释放雌配子素Ⅱ，雌配子素II封闭卵膜孔，并有破坏被吸引到卵的表面而不能进入卵的精子的作用。因此，动物的受精机制保证只有一个精子进入卵子受精（叶富良，2002）。由于雌、雄配子素的共同作用，最终使1个精子的头部由卵膜孔入卵，实现精卵两核的融合。当卵子的受精孔由于某些生理的或自然的原因不能及时封闭时，则可能有两个或多个精子进入卵子，并同时完成受精过程，进而形成三倍体（双精）、四倍体（三精）的合子而发育形成多倍体个体。这种双精入卵的生物学现象在植物中、动物中，以及高等动物中均有发现。在自然界中靠自然力量形成多倍体的机制，目前还没有通过该种方法人工诱导多倍体的先例。
124远缘杂交
不同二倍体物种之间杂交，当杂交的两个物种血缘关系较远，会产生杂交种不育现象；当血缘关系比较近时形成异缘二倍体杂交种，如鲤鱼和鲫鱼杂交得到的大鳞鲤是异源二倍体；如果遗传基础差异较大，杂交很难获得二倍体杂种，但有时远缘杂交可以导致远缘多倍体的形成，这一现象在鱼类等水产动物的远缘杂交中经常出现，尤其是附以一定的技术手段处理后更加容易获得异源多倍体。
125个体发育调节机制
动物体中，染色体、神经、体液调节的存在，对配子的产生、合子的形成、性别的决定和子代个体的发育有重要影响。多倍体动物之所以稀少，可能与染色体的性别决定有关。任何多于二倍体的染色体都容易造成动物的高度不育。如XY型性别决定中，当染色体加倍时，一个雄性二倍体加倍而成的四倍体，其性细胞的染色体组成为XXYY，产生的配子所含性染色体为XY，一个雌的二倍体加倍形成的四倍体，其性细胞的染色体组成为XXXX，产生的配子所含性染色体为XX。这两种配子受精，形成XXXY合子，既不是完全的雌性，也不是完全的雄性，因而是不育的。
13鱼类多倍体诱导
131人工诱导多倍体的原理
根据鱼类受精细胞学的研究，鱼类成熟卵处在第二次减数分裂中期，精子入卵受精后放出第二极体。按照生殖细胞发生和细胞分裂的机制，鱼类多倍体诱导原理如下。
1311抑制第二极体的释放
鱼类雌性配子发生中，经过染色体的加倍以后第一次减数分裂正常进行，含有二套染色体的第一极体照常排出，初级卵母细胞形成次级卵母细胞。然后继续进行第二次减数分裂，但停留在中期。此时受精刺激其继续进行分裂排出第二极体（含有一套染色体），形成具有一套染色体的卵原核。与正常的雄性原核（精子）结合形成正常的二倍体（附图1-2A）。如果在第二极体释放前，由于某些物理的或者化学的因素可以使第二极体的排出受阻，致使第二极体不能排出而与卵原核融合形成二倍体的卵原核。如果第二次减数分裂仅进行到中期即行结束，实际等于第二次减数分裂没有发生，也形成二倍体的雌性原核。由第二极体排出受阻而形成二倍体的雌性原核与正常的雄性原核（精子）结合形成三倍体个体（附图1-2B）。
通过第二极体受阻形成的三倍体称为减分II型三倍体（MII，meiosis II）。通过抑制第二极体排出诱导多倍体（三倍体）是较为成型的技术，被广泛的应用于多种水产动物的三倍体诱导之中，其中有许多企业已经利用此项技术进行商业化生产三倍体苗种。
1312抑制第一次卵裂
卵子和精子正常的结合形成正常的二倍体合子。合子形成以后很快进入卵裂期发生第一次卵裂。只要能在第一卵裂期间阻止纺锤丝的形成，使卵细胞的第一次有丝分裂成为核内有丝分裂，其结果是染色体复制，一个细胞内含双倍的二倍体染色体，由此发育为一个个体即为四倍体（附图1-2C）。抑制第一次卵裂的发生是目前诱导水产动物四倍体最为经济有效的方法。
14人工诱导多倍体产生的方法
多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，可以通过多种方法（因子）抑制极体的释放产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体。目前广泛应用的诱导方法有物理学、化学和生物学三种。
141物理学方法
受精卵的物理学处理方法已被广泛地用来抑制第二次减数分裂生产三倍体或第一次卵裂生产四倍体。主要包括温度休克、静水压力处理与电休克法等。
1411温度休克法
该方法是以改变环境温度来阻止卵母细胞正常分裂而产生多倍体。其原理是通过高温或低温温度短时间内休克（shock）细胞，使细胞中的纺锤丝被破坏。其最大的特点就是廉价、易操作，是诱导水产动物多倍体的常用手段，也适合大规模生产使用。根据处理温度的高低分为冷休克法（Cold shock）和热休克法（Heat shock）。即用略高于或低于致死温度的冷或热冲击来诱导多倍体。
（1）冷休克法。
其原理是低温能够阻止微管蛋白聚合成微管，从而阻止纺锤丝形成；纺锤丝被破坏以后则细胞不能正常分裂，极体不能形成并不能排出卵细胞。这一过程通常称为抑制极体的排放，由此可获得二倍体的卵核，将其与单倍体的精子受精即可获得三倍体。温度休克可以在第一次减数分裂期间（目前的技术只适用于某些无脊椎动物）进行（抑制第一极体的排出），也可以在第二次减数分裂中进行（抑制第二次减数分裂）。无论抑制哪一个极体的排出，均需要准确的处理时间，也就是减数分裂的中期，纺锤丝形成前和形成期间进行温度处理才能保证效果。如果诱导休克发生在第一次卵裂，则抑制了第一次卵裂的分裂过程，使卵细胞发生核内有丝分裂形成四倍体。
（2）热休克法。
若细胞处于较高温度环境中，或高温对细胞发生冲击，细胞内一些进行生命活动的重要酶类如ATP酶就会遭到破坏，从而使供能途径受阻，纺锤体不能形成，进而抑制了细胞的分裂。当将适宜的温度处理正在进行减数分裂的卵细胞时，纺锤体的破坏导致细胞分裂失败，极体不能排放，形成二倍体的卵原核，与正常精子受精即形成多倍体。热休克处理的时间与冷休克一致，即处理的时间必须刚好在减数分裂的中期以前及中期分裂纺锤丝形成期间，对于贝类可以是第一次减数分裂，也可以是第二次减数分裂;但对于鱼类目前仅对第二次减数分裂有效。如果诱导休克发生在第一次卵裂，则抑制了第一次卵裂的分裂过程，使卵细胞发生核内有丝分裂形成四倍体。
处理的温度同样因种类而异，喜冷性鱼类如鲑科鱼类宜用热休克，温度范围以不致死鱼卵或少量致死为度，多为28～36℃。而温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0～8℃，但最近研究表明，鲤鱼用热休克同样可以获得较高比例的三倍体。进行温度处理最重要的是必须确定处理的开始时间、持续时间，以及温度高低。
1412静水压处理
在天然水体中，水产动物尤其是鱼类产卵后，水位的突然变化（水深加大），导致卵所处环境的压力增大，这种静水压力适宜时，鱼卵减数分裂的纺锤丝会因压力的作用而裂解，导致二倍体卵子的形成，进而与正常精子受精得到三倍体。水压力的变化发生在第一次卵裂时，由于破坏了二倍体体细胞的纺锤丝的形成，导致类似于核内有丝分裂的现象发生则可能产生四倍体的个体。受此启发，将鱼卵采用较高的水静压处理（大约为650kg/cm2）来诱导多倍体简单易行。其原理是当细胞处于高压情况下微管所保持的结构失去原有的空间构型和刚性，微管发生可逆性裂解，破坏纺锤丝的形成，从而破坏了细胞分裂，抑制了第二极体的排出，或破坏了中期板的形成导致核内有丝分裂，进而诱导出多倍体。例如，欧洲鲶鱼受精后3min以600kg/cm2的静水压力处理鱼卵4min，结果得到978%三倍体胚胎，最后有337%的存活率；皱纹盘鲍的受精卵在受精后7min或22min分别施加650～750kg/cm2处理5min，诱发得到60%的三倍体。
静水压力处理方法的特点是诱导率较高（可达90%～100%）、处理时间短、受精卵损伤小、成活率高，但需要专门的设备—静水压力容器（图1-2），小批量生产成本较高。商业生产中多制造较大型的静水压力容器，既可保证诱导的质量，又可以批量生产，降低生产成本。目前已经商业化生产多倍体苗种的企业多数采用静水压力容器诱导方法。
图1-2静水压机
1413电脉冲休克
在一定的电场条件下，细胞与细胞之间的膜会发生融合，导致两个细胞合二为一，从而诱发多倍体（四倍体）。例如：将银大麻哈鱼受精40min后的卵置于26℃并给以10min的交流电脉冲休克处理可得到100%的三倍体。
142化学方法
一些化学物质可以破坏细胞分裂中纺锤体的形成，进而阻止卵细胞极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生多倍体。
1421秋水仙素（Colchicine，分子式：C22H25NO6·12H2O）
秋水仙素是从百合科植物秋水仙的种子、鳞茎中提取的生物碱。它能抑制微管的组装，使已有的微管解聚合，阻止纺锤体的形成或破坏已形成的纺锤体，从而导致核内有丝分裂形成多倍体细胞。在去除秋水仙素后，其作用立即结束，细胞恢复正常的生理状态。该种诱导剂在植物育种中的应用较为广泛，且有许多成功的例子。在水产动物中或其他动物中的应用较少。
1422细胞松弛素B（Cytochalasin B，分子式：C29H37NO5，简称CB）
细胞松弛素B是真菌的一类代谢产物，是水产动物育种中最常用的一种化学诱导药物。细胞松弛素B处理细胞可诱发一系列细胞学效应，如细胞骨架的变化、多核化、破坏微丝等。一般认为细胞松弛素B特异性破坏微丝，最终导致控制细胞分裂的由微丝构成的收缩环的解体，抑制细胞质分裂，阻止极体的释放，从而产生多倍体。细胞松弛素B是一种致癌物质，水溶性较差。一般用细胞松弛素B处理受精卵，将其溶解在1％的二甲基亚砜（DMSO）中配制成一定浓度的药液，处理结束后需用含1% DMSO的溶液浸洗受精卵，去除残留的细胞松弛素B。
1423聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）
聚乙二醇是一种常用的细胞融合剂，能使细胞发生融合作用，从而使染色体加倍。该药物被广泛的应用于试管内的细胞融合，如单克隆抗体的制备等方面。由于其特殊的理化特性，也将其应用于水产动物的多倍体诱导。Ueda等（1986）用聚乙二醇处理虹鳟精子，然后授精，获得了2/5的三倍体胚胎，经染色体核型分析，两套染色体来自父本，一套来自母本。证明三倍体的形成是由融合的双精子授精所致。
14246-二甲基氨基嘌呤（6-Dimethylaminopurine，分子式：C7H9N5，简称：6-DMAP）
6-二甲基氨基嘌呤是嘌呤霉素的一种类似物，其生理作用是抑制蛋白质磷酸化，通过作用于特定的酶，破坏微管的的聚合中心，使微管不能形成，从而破坏细胞分裂，抑制卵细胞极体的形成和释放。6-DMAP非致癌性，具水活性。洗除该药物后，受精卵可以正常发育。6-DMAP低毒、高效、价格便宜，在诱导多倍体方面表现出较大的优越性和较广阔的应用前景。
1425咖啡因（Caffeine）
咖啡因是一种生物碱，化学名为1，3，7-黄嘌呤，又称三丙黄嘌呤。它无色无味，存在于多种植物之中。咖啡因进入细胞后可以立即提高细胞内的Ca2+浓度，由于微管对Ca2+浓度敏感，当Ca2+浓度极低或高于10-3时，会引起微管二聚体的解聚，阻止细胞分裂，从而形成多倍体。
143生物学方法
远缘杂交、核移植及细胞融合是采用生物方法诱导鱼类多倍体的有效途径。
1431远缘杂交
在许多情况下，血缘比较远的物种之间是不能雌雄配子杂交产生后代的，有些虽然可以成功的杂交但杂种后代不育，这是因为物种间遗传基础的差异导致的。例如马和驴杂交，其后代为骡子，是严重不育的典型。杂交失败主要是配子之间不亲和性以及染色体之间配对的失衡导致的，亲本配子染色体加倍可以使染色体达到平衡，从而克服远缘杂交的困难获得多倍体的杂交种，因此，远缘杂交可以产生异源多倍体（Heterologous polyploid）。远缘杂交产生多倍体多为三倍体，但也有产生四倍体的报道。吴维新等（1988）在草鱼和红鲤的远源杂交组合中获得了数尾自然加倍的异源四倍体鱼，但是由于后代性状分化严重，在生产上没有应用价值。刘筠等（1986）自20世纪70年代以来，在鲤科鱼类的属间和不同亚科之间的远源杂交中分别获得为数众多的三倍体鱼和四倍体鱼群体。其中，在湘江野鲤（♂）× 红鲫（♀）获得F1 中发现部分可育的二倍体个体，自交获得了F2；在F2 自交后所得的第三代（F3）中发现有四倍体个体即异源四倍体鲫鲤。异源四倍体鲫鲤雌雄两性可育，遗传性状稳定，已形成了一个染色体数目为4n=200的新种。刘少军等（2007）在团头鲂（♂）× 红鲫（♀）F1 中获得了四倍体鲫鲂，四倍体鲫鲂（Ⅱ龄）达到性成熟，且雌雄两性可育。
1432核移植及细胞融合
核移植诱导鱼类多倍体技术仍处于实验阶段，试管内的细胞融合可以产生多倍体细胞，陆仁后等（1982）用四倍体的草鱼培养细胞的细胞核作为供体移植到泥鳅的去核卵内，获得心跳期的四倍体胚胎。该技术的成熟，很可能成为诱导四倍体鱼类的有效途径之一。活体体细胞之间的融合能直接产生多倍体个体，可以通过电脉冲等来实现，主要诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或者受精卵与受精卵之间的细胞融合。易泳兰等（1988）将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育得到了35%的融合鱼苗。
前面已经叙述体外用人工方法将两个精子融合后授精得到三倍体后代，人工注射两个精子代替自然受精过程也是一个生产多倍体的途径。
1433四倍体与二倍体杂交生产三倍体
目前对三倍体诱导的大量工作表明：很难有一种方法能100%的产生三倍体，且操作烦琐，每年进行诱导培育，使用昂贵的仪器，所用药品毒性大、价格昂贵，生产成本较高。四倍体与正常二倍体杂交，从理论上讲可以产生100%不育的三倍体（图1-3），从而实现大量、安全、方便、可靠的生产三倍体。该方法具有可操作性、连续性和经济性等方面的优势，是实现三倍体产业化的最好途径。这一方法首先需要获得四倍体，由于阻止第一次卵裂较阻止极体的排出难得多，因而获得四倍体的难度相对要较诱导生产三倍体大得多。目前仅在鱼类中获得了有价值的四倍体，例如虹鳟受精卵用CB处理，以及用热休克和静水压处理都获得了四倍体，用四倍体已经可以商业化生产虹鳟三倍体苗种。刘筠等用鲫和鲤交杂获得四倍体鲫鲤，然后将其与鲤鱼或鲫鱼回交获得了三倍体的杂种，分别称为湘云鲤和湘云鲫。另外已经获得奥利亚罗非鱼的四倍体个体，兴国红鲤与草鱼异源四倍体，鲢鱼的四倍体。李雅娟等（2010）利用自然四倍体泥鳅与二倍体杂交生产了杂交三倍体泥鳅。
通过四倍体与二倍体的交配生产三倍体时，多用四倍体作母本，二倍体作父本。这是因为可以保证较高的受精率。如果将四倍体作父本，则因为精子的头部较大，二倍体的卵子的受精孔较小导致受精率低下。
图1-3四倍体雌鱼与二倍体雄鱼杂交培育三倍体
15多倍体的鉴定
由于经人工处理的受精卵不能保证百分之百地成为多倍体，而且所形成的多倍体常常表现为嵌合体，因此进行染色体倍性鉴定对于确认诱导效果就显得十分必要。鉴定方法分为直接和间接两种方法。直接方法包括染色体计数和DNA含量测定等，间接方法包括细胞测量、蛋白质电泳、生化分析和形态学检查。现将常用的鉴定方法介绍如下。
151染色体计数法
通过制备染色体玻片标本后直接计数细胞中的染色体数并与正常二倍体相对照进而确定倍性的方法，是鉴定倍性最直接可靠的方法。
1511肾脏组织染色体制片法（以德国镜鲤为例）
（1）PHA和秋水仙素处理。
每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液，剂量为12μg/g（鱼/体重），18～20h后第二次注射同样剂量PHA，作用4～6h后，活体腹腔注射01%秋水仙素，溶液剂量为6μg/g（鱼体重），效应时间2～3h。
（2）取材与低渗。
配制2～4mg/kg的麻醉剂将鱼麻醉，剪尾鳍放血5～10min，取头肾剪碎于淡水生理盐水中，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，加入08%的柠檬酸三钠溶液低渗40～45min。
（3）固定。
低渗结束后，离心5min（1 000r／min）。弃上清液，放入甲醇冰醋酸=91的固定液中固定7～10min，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，转入100%冰醋酸中处理1～2min，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，再将肾组织块移入新配制预冷的卡诺固定液（甲醇冰醋酸=31）中，每隔15min更换一次固定液，重复3次，固定完毕放入青霉素小瓶中，加入新的固定液，用封口膜封口放入冰箱冷冻过夜。
（4）制片。
将固定过的样品取少量组织块于5ml小烧杯中，加入2～3滴50%冰醋酸，将组织制成细胞悬液后，加少量新配制的固定液，过滤后进行冷滴片法滴片过火，看到玻片上燃烧蓝色火焰即可。室温自然干燥。
（5）染色和镜检。
完全干燥的染色体玻片用体积分数为10%的Giemsa（pH＝68）染色液染色1～2h，蒸馏水冲洗，自然干燥。利用显微镜进行观察拍照（附图1-3）。
1512鱼类鳃细胞染色体标本制备
（1）PHA和秋水仙素处理。
用2～4mg/kg苯甲醇麻醉鱼，称重。每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液,剂量为6μg/g（鱼体重），18～20h后第二次注射同样剂量PHA，作用4～6h后，活体腹腔注射01%秋水仙素溶液，剂量为6μg/g（鱼体重），效应时间2～3h。
（2）取材。
用2～4mg/kg苯甲醇麻醉鱼，剪尾鳍放血5～10min。取鳃放入装有淡水生理盐水中的小烧杯中，不剪碎。
（3）低渗。
加入2ml 8‰的柠檬酸溶液室温下低渗40～45min。
（4）固定。
低渗后放入甲醇冰醋酸=91的固定液中固定7～10min，再转入100%冰醋酸中处理1～2min，再在常规甲醇冰醋酸=31的固定液中固定2～3次，每次15min，完毕后放入冰箱冷冻过夜。
（5）滴片。
将固定过的样品吸去固定液，加入1～2滴50%冰醋酸，用镊子将鳃丝轻轻抖动，用手术剪将鳃剪碎，制成细胞悬液后，加少量新配制的固定液，用筛绢网过滤。取预冷湿玻片一张用吸管吸取过滤后的细胞悬液，从30cm左右的高度滴到载玻片上，用口吹散滴液，置于酒精灯上过火，看到玻片上燃烧蓝色火焰即可，最后摆放到解剖盘中室温下自然风干。
（6）染色。
完全干燥的染色体玻片用pH值为74的磷酸缓冲液配制的体积分数为10%的Giemsa染色液染色1～2h，自来水冲洗，自然风干。
（7）镜检，拍照。
先在低倍镜下观察，选择染色体形态良好、分散适中的中期分裂相，然后换油镜拍照。四倍体泥鳅鳃细胞染色体相参见附图1-4。
1513胚胎细胞染色体标本制备
取发育至肌肉效应期的红鳍东方鲀的受精卵各40个，分别放入铺有琼脂糖的培养皿中，加入适量生理盐水，在解剖镜下用钟表镊子剥去卵膜、卵黄，00025%秋水仙素浸泡45min，08%柠檬酸低渗15～20min，用预冷的卡诺固定液（甲醇冰醋酸=31）重复固定3次，每次15min，冷冻（-20℃）过夜。次日吸出一个胚胎到4孔载玻片上，滴1～2滴50%冰醋酸，用黄枪头捣碎呈细胞悬液，再加入一滴预冷的卡诺固定液，用枪头混匀，吸出所有液体，进行冷滴片，过火，风干，10%吉姆萨染色30min后冲洗，风干，镜检，拍照（附图1-5）。
152核仁银染法（Ag-NORs）
细胞的核仁数目与倍性有关，在正常情况下，单倍体细胞含一个核仁，二、三、四倍体细胞分别含二、三、四个核仁。在多倍体鱼类的倍性鉴定中，银染核仁组织区法与其他多倍体鱼类的倍性检测方法相比，不但快捷准确而且省时省力，无须特殊的仪器,在条件相当简陋的实验室就可以进行操作，是值得推广的一种好方法。
具体操作方法主要参照Howell and Black（1980）的快速银染法并略加修改。50%AgNO3与明胶溶液21在染色体片子上混合，加盖玻片，70℃恒温箱中处理2～3min，用70℃去离子水冲洗，自然干燥；干燥后显微镜下观察，拍照（图1-4）。
图1-4德国镜鲤间期细胞核Ag-NORs 标尺示10μm
153细胞核体积测量法
同一研究对象的二倍体和多倍体个体，其细胞核及细胞大小不同。二倍体与三倍体、四倍体血红细胞核体积预期比值为1152。
红细胞测量的具体操作简单。以泥鳅为例（附图1-6）。
（1）血涂片的制备。麻醉鱼采用一次性注射器从实验鱼尾部静脉处采血，涂片后用甲醇固定3～5min，吉姆萨染液染色5min。
（2）镜检拍照。先用低倍镜下观察，找到细胞分散均匀、不重叠、不变形的视野，换高倍镜观察后用数码显微拍照。并在同样倍数下拍台微尺。
（3）用Adobe Photoshop软件测量。计算核体积=4/3πab2或=ab2/191，式中a—为长半轴，b—为短半轴。
154极体计数法
极体计数法已作为一种简单快速的方法用于早期胚胎三倍体的检测（Beaumont等，1986）。观察鱼类极体释放的具体方法是将受精卵用波恩固定液固定后，用刀片将卵黄切除，依常规方法脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，染色（一种是用DAPI染色，另一种是苏木精，曙红双重染色）以后步骤与正常的组织切片相同（附图1-7）。
155DNA含量测定方法
细胞核内的DNA含量与它们所含的染色体数成比例，当细胞内染色体倍数增加时，其DNA含量也相应增加，所以可以通过DNA含量来确定染色体数目的多少。
1551流式细胞仪
用流式细胞仪测定细胞DNA含量具体方法（以泥鳅为例）。
（1）机械法。剪取约5mm×5mm大小的尾鳍,放置于干净的小培养皿中,用刀片将尾鳍剁碎；将剁碎的样品转入样品管中,加入DAPI染液,用SK-1快速混匀仪振荡10～15s,使细胞脱落游离；用300～500目小筛网过滤混悬液到测试小管中,制得细胞悬液,使样品管液体体积最终在15～2ml,样品细胞的最终浓度为105～106个/ml。
（2）抽取血液法。用经肝素润湿的一次性注射器在尾静脉抽血002～003ml，注入加有1ml淡水生理盐水的离心管中，轻轻摇动使血液混匀；用滴管抽取血液混合液一滴到测试小管中，加入10～15mlDAPI染液,上机进行测试。检测结果以DNA直方图的形式表示，图中横坐标代表DNA的相对含量，纵坐标代表细胞频率。从图中可看出三倍体泥鳅的DNA含量是二倍体泥鳅DNA含量的15倍；四倍体泥鳅的DNA含量是二倍体泥鳅DNA含量的2倍（图1-5）。
A:二倍体；B：三倍体；C：四倍体
图1-5泥鳅流式细胞仪倍性检测结果
1552显微荧光测定法
将被测材料用固定液固定后，将组织用细胞匀浆仪弄碎，使细胞游离制成涂片标本，或者采取血液制成血涂片固定。标本用DAPI染色，然后在显微分光光度计，通过365nm长的紫外线，用扫描测光装置测定细胞核的荧光强度，获得处理组个体和对照组个体之间细胞核DNA相对含量曲线，从而测出二者的DNA比率，即可确定处理组个体的倍性，进而计算出三倍体的诱发率。
16多倍体的生物学特性
161性腺发育
人工诱导的三倍体鱼类预期是不育的，因为奇数染色体组将导致减数分裂姊妹染色体配对的不平衡而不能进行，由此引发性腺发育的受阻或非整倍体配子的产生，已有许多研究证明了这一点。如诱发尼罗罗非鱼三倍体雌雄皆为不育；三倍体草鱼和三角鲂杂种的雌性完全不育，雄性个体的生殖细胞只能发育到精原细胞阶段，也为不育；三倍体的鲤鱼性腺不能发育；黑鲷三倍体性腺明显小于二倍体，即使2～4龄的性腺能产生精子但其形态异常且浓度较低。一般三倍体雄鱼比三倍体雌鱼呈现较好的性腺发育。
四倍体个体的性腺发育正常，但育性较二倍体表现差。李建中等（2002）采用组织切片技术对异源四倍体鲫鲤的性腺进行研究，结果表明，异源四倍体鲫鲤的性腺发育是正常的，雌雄个体都能达到性成熟。两性可育并遗传稳定的四倍体鱼为探讨自然界鱼类多倍体形成机制提供了重要的理论依据，为鱼类多倍体育种提供了新的途径。
162生活力与生长
大多数学者的研究发现，人工诱导的三倍体鱼类具有正常的生活力。如三棘刺鱼、鲽与川鲽杂种、奥利亚罗非鱼、鲤、草鱼以及斑马鱼等的生活力与同种的二倍体没有明显的区别。但也有例外，如虹鳟和银大麻哈鱼等人工诱导三倍体的生活力比二倍体差一些。
在早期生长上，有的三倍体鱼要比二倍体快。吴清江等（1979）用红鲤×镜鲤得到的三倍体孵出的8个月内体重比二倍体重26～263倍。三倍体奥利亚罗非鱼14周时，其个体比二倍体鱼个体大。但更多的研究表明三倍体和二倍体两者在早期生长方面无明显差异。还有例子表明三倍体鱼的生长低于二倍体。
163其他性状
经过对鱼肉质量、含氧量、抗病性和感觉特性等性状的研究发现三倍体虹鳟的鱼肉质量优于二倍体；三倍体大西洋鲑需氧能力低于二倍体，故可适于低氧环境养殖；三倍体香鱼的抗病力与二倍体无明显差异。
多数情况下三倍体的个体不比二倍体大，这必然伴随三倍体个体细胞数量的减少，同时也伴随各个器官细胞数量的减少。脑细胞数量的减少导致三倍体的智力可能比二倍体低下，这有可能使三倍体的竞争力较低。同样分泌器官细胞数量的减少也可能使调节免疫力等的物质的分泌量减少，如激素等。
17多倍体的应用
171提高生长速度
由于三倍体不需要消耗能量用于生殖腺发育，可将所有的能量用于生长，故三倍体的生长速度在性成熟期间及以后会具有生长优势。从水产养殖角度出发，人工诱导三倍体的兴趣多半是寄希望于三倍体会比二倍体生长得更快，其生长情况因种类和发育阶段而异。研究发现，在性成熟时，三倍体普遍比二倍体生长快。三倍体鱼早期生长与二倍体相比没有什么优势，但到了产卵期，其生长速度明显快。生物的生长往往在性成熟以后会停滞或大幅度的减慢，有人期望三倍体因性腺不发育，因此也就不会停止身体的生长，这样养殖生产即可以获得较大个体的养殖对象，例如，期望大麻哈等鱼类的三倍体可以生长到金枪鱼那样大小。
172控制过度繁殖
三倍体鱼类的性腺不发育，所以不会产生后代，这为三倍体的生物学利用提供了广泛的空间。可以用养殖不育的群体控制养殖密度，例如罗非鱼的繁殖能力较强，且一年数次产卵，导致养殖水体中数代同塘，个体大小非常不匀，放养三倍体则不会产生此类问题。用三倍体群体完成一些短期的目标，目标完成以后群体也自然消亡，如在杂草丛生的水体放养不育的草鱼三倍体既能除草又可防止因其繁育后代导致的生态变化。此项技术在鲍鱼、珍珠贝上效果也特别明显。
173延长寿命
对于那些在性成熟时会遭受损失或有成熟死亡的鱼类来说，不育三倍体可能比二倍体存活得更长久。在鲑鳟鱼类中如虹鳟在缺乏产卵支流的湖泊中会有很高的死亡率，又如大麻哈鱼等降海的鲑科鱼类一生产卵一次，产卵后通常死亡（成熟死亡），而三倍体大麻哈鱼就不存在这种情况，它的性腺不发育，因此就不会性成熟，也就不会因性成熟而发生成熟死亡。香鱼和公鱼的寿命很短，一般是在秋季产卵繁殖，而后结束其一生，而三倍体香鱼可以跨年生长，还可以全年上市销售。
174改善品质
三倍体物种的细胞体积大，因此同样大小的二倍体和三倍体，三倍体的细胞数量要少于二倍体，相对的筋膜等也少于二倍体，并且三倍体的鱼肉看起来较有光泽，因此三倍体个体的肌肉的口感柔软，更受消费者的偏爱。Wolters等（1982）认为，三倍体斑点叉尾具有比二倍体小的头部，这样净肉率高于二倍体，在加工过程中浪费较少。三倍体香鱼的鱼片厚度平均比二倍体高；三倍体和二倍体鲽与川鲽杂种也有同样情况。
性成熟的动物往往伴随着肌肉质量的下降，动物生产中采取阉割的办法避免肌肉质量下降。对于那些无法采用阉割技术的动物，则在性成熟前上市保证肌肉的品质。所以欧美国家消费虹鳟等鱼类时，偏好个体较小的未成熟个体。三倍体的鱼类因性腺不发育，生长中没有肌肉质量下降的问题。
18多倍体泥鳅研究现状
泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是广泛分布在中国大陆、朝鲜半岛、日本列岛、台湾等地的鲤形目、鳅科、泥鳅属的小型淡水鱼类（斉藤憲治，1989）。泥鳅肉质鲜美，营养丰富，富含蛋白质及多种维生素，并具有药用价值，被誉为“水中人参”（刘孝华，2008）。泥鳅具有广阔的市场前景（谷士荣，2011），在我国南北各地，泥鳅作为滋补佳品早已摆上家庭、酒店的餐桌，日本和韩国人视其为高档营养食品，更是畅销不已。据国内外泥鳅市场调查显示，从2001年至今，连续走俏市场。价格连年攀升。但由于多年的过度捕捞，自然水域生态环境日益恶化，我国野生泥鳅的产量正逐渐降低，泥鳅已经成为我国目前主要的养殖品种。随着养殖规模的逐渐扩大，高产、高效的优良品种已成为泥鳅养殖业发展的瓶颈之一。三倍体鱼类以其育性差、生长快等特性而成为鱼类遗传育种研究的热点。因此，规模化培育三倍体泥鳅，对促进泥鳅养殖生产的发展，将具有重要的经济价值和广阔的应用前景。
泥鳅的倍性一直受国内外学者所关注。国外主要集中在日本，1979年，日本学者Ojima和Takai（1979）首次在野生群体的泥鳅样本中发现染色体数为2n=50的二倍体、3n=75的三倍体和来自水产品市场的（来源不明）4n=100的四倍体个体。Arai研究室历经20多年对日本产自然三倍体及起源不明的四倍体（来源市场）进行了系统的研究。发现日本除正常有性生殖的二倍体泥鳅外，还存在无性生殖二倍体和杂种生殖的三倍体，但没有发现自然四倍体（Morishima K et al.，2002；Arai K et al.，1991；Zhang Q et al.，1999；荒井克俊，2004）。日本产三倍体是由于同一栖息场所的二倍体泥鳅产生二倍体未减数卵与精子偶尔受精形成的，这些未减数的二倍体卵，精子不参与通过雌核发育进行繁殖。因此，把这种二倍体称为无性生殖二倍体，经细胞学研究表明，无性生殖二倍体的未减数卵的细胞学机制是减数分裂前核内有丝分裂（荒井克俊，2004）。并通过线粒体DNA序列及微卫星分析进一步证明了日本泥鳅分为两个不同的种类，无性生殖二倍体是由两个不同种间泥鳅杂交形成的（Kagayaki Morishima et al.，2008）。通常人工诱导的三倍体无论雌雄都不育，而日本产自然三倍体雄的不育，雌的可以产生单倍体（1n）和三倍体（3n）卵。并证实了起源不明的四倍体是遗传的四倍体（2n=100），同时利用起源不明的四倍体通过人工繁殖实验及染色体操作培育出三倍体、四倍体、五倍体及六倍体，并对其后代的染色体数目、成活率等生殖特性进行了详细的研究（荒井克俊，2009）。
我国关于自然多倍体泥鳅的研究以往报道较少。主要集中在四倍体核型（李康等，1983；李渝成等，1987；印杰等，2005）、倍性鉴定（李雅娟等，2008；高泽霞等，2007；郭伟荣等，2009）、细胞色素b基因序列（Yang C et al.，2009）、群体遗传结构（周玲玲等，2011）、线粒体基因多态性（郑鹏飞等，2011）等研究上。本书著者从2004—2011年与日本北海道大学荒井克俊教授进行了合作研究。为探讨中国天然多倍体泥鳅的分布、起源及形成机制，对中国泥鳅线粒体DNA序列分析、自然多倍体的分布、体细胞染色体核型分析、染色体带型和FISH研究、减数分裂染色体行为、人工诱导雌核发育及生殖特性等方面进行了系统的研究。初次证实了我国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体(4n=100)、是同源四倍体、能产生正常的2n配子（雌或雄）。2012—2016年李雅娟主持的国家自然科学基金项目“泥鳅杂交三倍体染色体组稳定性及其表观遗传机制解析（31272650）”首次利用天然四倍体泥鳅与二倍体杂交制备了1种新型的杂交三倍体，并对早期的染色体数目、DNA含量、生殖特性、减数分裂行为、性腺发育及表观遗传机制等进行了研究。从表观遗传学的角度对杂交三倍体泥鳅及其亲本DNA甲基化水平差异和关键基因的甲基化调控机制进行分析，探索杂交三倍体优势性状的表观遗传机理。从而促进杂交三倍体泥鳅杂种优势的形成。为今后鱼类三倍体杂种优势形成机理提供理论与技术支持。为我国三倍体鱼类的产业化探索高效易行的新途径奠定基础。
第2章中国自然多倍体泥鳅的分布、染色体核型及形态特征
《中国自然多倍体泥鳅的遗传学研究》编辑推荐：泥鳅的天然多倍体与二倍体共存的现象使之成为研究鱼类的细胞地理学、发育生物学和遗传育种学等领域的理想原材料。
作者简介
李雅娟，系大连海洋大学职工，李雅娟，博士，大连海洋大学水产与生命学院教授，承担国家“863”、国家自然科学基金、省重大、重点项目、省基金等多项科研项目。
目录
第1章绪论
1.1鱼类染色体的多倍性
1.2鱼类自然多倍体形成机制
1.3鱼类多倍体诱导
1.4人工诱导多倍体产生的方法
1.5多倍体的鉴定
1.6多倍体的生物学特性
1.7多倍体的应用
1.8多倍体泥鳅研究现状
第2章中国自然多倍体泥鳅的分布、染色体核型及形态特征
2.1中国自然多倍体泥鳅的分布
2.2中国自然多倍体泥鳅染色体核型及形态特征
第3章中国自然多倍体泥鳅线粒体DNA控制区的序列分析
3.1引言
3.2材料与方法
3.3结果
3.4讨论
第4章中国自然四倍体泥鳅分子细胞遗传学研究
4.1二倍体、四倍体泥鳅的银染核型
4.2CMA3／DA／DAPI三重荧光染色
4.3人5.8S+28SrDNA—FISH
第5章中国自然四倍体泥鳅染色体构成研究
5.1引言
5.2材料与方法
5.3结果
5.4讨论
第6章中国自然四倍体泥鳅染色体减数分裂行为
6.1引言
6.2材料与方法
6.3结果
6.4讨论
第7章中国自然多倍体泥鳅生殖特性研究
7.1引言
7.2材料与方法
7.3结果
7.4讨论
第8章不同倍性及亲子代泥鳅的DNA甲基化差异分析
8.1泥鳅MSAP技术反应体系的建立及优化
8.2不同倍性及亲子代泥鳅的DNA甲基化差异分析
第9章杂交三倍体泥鳅培育及染色体组稳定性研究
9.1杂交三倍体泥鳅早期胚胎染色体组成研究
9.2不同倍性泥鳅杂交后代染色体数目组成的研究
9.3二倍体泥鳅×四倍体泥鳅F1的不同发育阶段染色体核型分析
第10章杂交三倍体泥鳅减数分裂及配子染色体研究
10.1杂交三倍体泥鳅的减数分裂
10.2杂交三倍体泥鳅精母细胞染色体的带型及rDNA定位
第11章杂交三倍体泥鳅的生殖特性
11.1引言
11.2材料与方法
11.3结果
11.4讨论
第12章杂交三倍体泥鳅配子染色体组构成的研究
12.1引言
12.2材料与方法
12.3结果
12.4讨论
第13章不同倍性泥鳅鳍细胞系的建立及生物学特性分析
13.1引言
13.2材料与方法
13.3结果
13.4讨论
第14章氯化镉对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应
14.1引言
14.2材料与方法
14.3结果
14.4讨论
第15章杀虫单对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性作用
15.1引言
15.2材料与方法
15.3结果
15.4讨论
参考文献
附图
序言
第1章绪论
11鱼类染色体的多倍性
一个物种细胞中染色体形态结构和数目的恒定性是这个种的重要特征。二倍体生物在有性繁殖过程中，或者是生物体世代交替中，能维持配子正常功能的、最低数目的一套染色体（chromosome set）称为染色体组或基因组（genome）。进行有性生殖的生物把含有2套染色体组的称为二倍体（diploid，2n），含有3套、4套染色体组的生物分别称为3倍体（triploid,3n）和4倍体（tetraploid,4n）。多倍体（Polyploid）最早是由德国学者Winkler（1916）诱发植物多倍体成功后首先提出来的。它是指生物体体细胞中含有3套或3套以上染色体组的个体。由于多倍体生物具有比二倍体多出一倍或以上的基因和复等位基因的变异，所以拥有更高的代谢能力和物质合成能力。多倍化是生物进化变异的自然现象，也是促进生物发生进化改变的重要力量。据不完全统计，植物界中被子植物有30％～80%是多倍体，大约70%显花植物在进化过程中进行多倍化。但动物中的多倍体现象比较少。在低等动物中，如甲壳类中的盐水丰年虾为四倍体；线形动物中的马蛔虫为同源四倍体（4n=4）。昆虫中的多倍体现象又总是与孤雌生殖方式联系在一起。在水产动物中，多倍体现象比较普遍。世界上现存鱼类约有2万多种，已研究过染色体的鱼类约有1 100余种，其中多倍体至少有60种（桂建芳，1985；马纲，1996）。许多多倍体种类是重要的经济鱼类或重要的养殖对象。例如鲑科的虹鳟、白鲑、各种大麻哈鱼和茴鱼是四倍体；胭脂鱼科中几乎所有的种类都是四倍体；鲫鱼的变种—金鱼中除了四倍体外，还有三倍体如银金鱼。此外，还有四倍体的泥鳅和三倍体的花鳟鱼、鲫鱼等。开展鱼类自然多倍体的研究，对查明我国多倍体鱼类资源及合理开发利用这些资源具有十分重要的意义。
从来源上分析，如果加倍的染色体来自于同一物种或在原有染色体组的基础上加倍而成，则称为同源多倍体（homologous polyploid）（图1-1），如虹鳟鱼的受精卵用温度休克处理抑制第一次有丝分裂进而获得虹鳟鱼同源四倍体，其子代的染色体完全来源于同一物种虹鳟。如果加倍的染色体来源于不同的物种，则称为异源多倍体（heterologous polyploid）（图1-1），如用白鲫（2n=100）为母本，红鲤（2n=100）为父本进行属间杂交，受精卵再经温度休克处理抑制第一次有丝分裂使染色体加倍，结果获得四倍体鲤鲫杂种鱼苗（4n=200），其中父母本的染色体各占一半。
注：直线表示杂交；粗箭头表示染色体加倍；A、B代表染色体组
图1-1同源与异源四倍体形成过程
12鱼类自然多倍体形成机制
121体细胞染色体加倍
体细胞在有丝分裂中期发生分裂异常现象（核内有丝分裂、核内复制或分裂后两个子细胞的融合）导致染色体加倍分裂失败，形成染色体数目加倍的多倍体细胞，进而形成一定的多倍体组织或器官。所谓核内有丝分裂（endomitosis），是体细胞在正常有丝分裂中，染色体复制一次，但至分裂中期，核膜没有破裂、消失，也无纺锤丝的形成，当然也不会发生细胞分裂中后期的细胞质分裂，因此每个染色体形成四条染色体，称为双倍染色体（diplochromosome），这时染色体两两平行排列在一起，结果形成的细胞是四倍体。其后经过正常的细胞分裂，形成两个子细胞均为四倍体。这一过程发生在受精卵的第一次有丝分裂，即形成四倍体个体，若发生在性腺细胞则产生二倍体的配子，与二倍体交配则产生三倍体。日本北海道女满别街存在高频率的三倍体，经细胞遗传学研究三倍体是由同一栖息场所的二倍体泥鳅产生二倍体未减数卵与精子偶尔受精形成的，这些未减数的二倍体卵，精子不参与通过雌核发育进行繁殖。因此，把这种二倍体称为无性生殖二倍体，经细胞学研究表明，无性生殖二倍体的未减数卵的细胞学机制是减数分裂前核内有丝分裂，其原理如附图1-1所示。这种多倍体的组织或器官在动物和植物都可能出现，但动物和植物体上的发育结果是有明显差别的。动物体细胞染色体加倍后一般体细胞不能进行无性生殖而传留，只有当染色体加倍的细胞是生殖细胞时，这种变异才有可能传留，而且要求这一变异的个体恰好遇到了发生同一变异的异性，并有机会交配生殖才能有可能传留后代；同时，多倍体的动物因为生殖生物学方面的原因会遇到不育或育性不良的现象，因此动物多倍体传留后代的机会很少。
122生殖细胞的异常减数分裂
由于某种原因生殖细胞的同源染色体或姐妹染色单体在后期没有分开，二组染色体进入到同一配子中，导致配子中染色体数目的加倍形成2n配子。这样的配子经授精后形成倍性不同于亲代的多倍体，如三倍体、四倍体等，但其子代的可育性很低。从现有对多倍体细胞减数分裂研究结果看，奇数性动物多倍体中能形成的平衡配子的数目都极少。同源三倍体在减数分裂的后期，无论配成是一个双价体和一个单价体，还是配成一个三价体，平衡配子的类型只有二种，一种是n条染色体的配子,另一种是2n条染色体的配子，这两种类型的配子都是可育配子（平衡配子）。当所有的染色体都是每一条都进入同一极，则形成具有n条染色体的配子，其概率为（1/2）的n 次方，同时另一极则具有2n条染色体，也是可育配子，即同时产生2个可育配子，因此由（1/2）的n次方乘以2，这样就等于（1/2）的n-1次方（刘祖洞，1990），如3n的个体，只有（1/2）n-1个平衡配子。高等动物中，虽然雄配子一次产生的数量较多，但雌性个体一次产生的雌配子数目较少，因此，高等动物中能够形成平衡多倍体子代的可能性当然也就极小，实际存在的多倍体种类也就比较少（叶名文，1998）。
123双（多）精受精
在一些鱼类中是精子产生雄配子素Ⅱ，溶解卵膜孔的卵膜形成受精孔。卵子的卵膜孔区有两种雌配子素，雌配子素Ⅰ有吸引和加速精子活动的作用，一个精子进入卵子以后立即释放雌配子素Ⅱ，雌配子素II封闭卵膜孔，并有破坏被吸引到卵的表面而不能进入卵的精子的作用。因此，动物的受精机制保证只有一个精子进入卵子受精（叶富良，2002）。由于雌、雄配子素的共同作用，最终使1个精子的头部由卵膜孔入卵，实现精卵两核的融合。当卵子的受精孔由于某些生理的或自然的原因不能及时封闭时，则可能有两个或多个精子进入卵子，并同时完成受精过程，进而形成三倍体（双精）、四倍体（三精）的合子而发育形成多倍体个体。这种双精入卵的生物学现象在植物中、动物中，以及高等动物中均有发现。在自然界中靠自然力量形成多倍体的机制，目前还没有通过该种方法人工诱导多倍体的先例。
124远缘杂交
不同二倍体物种之间杂交，当杂交的两个物种血缘关系较远，会产生杂交种不育现象；当血缘关系比较近时形成异缘二倍体杂交种，如鲤鱼和鲫鱼杂交得到的大鳞鲤是异源二倍体；如果遗传基础差异较大，杂交很难获得二倍体杂种，但有时远缘杂交可以导致远缘多倍体的形成，这一现象在鱼类等水产动物的远缘杂交中经常出现，尤其是附以一定的技术手段处理后更加容易获得异源多倍体。
125个体发育调节机制
动物体中，染色体、神经、体液调节的存在，对配子的产生、合子的形成、性别的决定和子代个体的发育有重要影响。多倍体动物之所以稀少，可能与染色体的性别决定有关。任何多于二倍体的染色体都容易造成动物的高度不育。如XY型性别决定中，当染色体加倍时，一个雄性二倍体加倍而成的四倍体，其性细胞的染色体组成为XXYY，产生的配子所含性染色体为XY，一个雌的二倍体加倍形成的四倍体，其性细胞的染色体组成为XXXX，产生的配子所含性染色体为XX。这两种配子受精，形成XXXY合子，既不是完全的雌性，也不是完全的雄性，因而是不育的。
13鱼类多倍体诱导
131人工诱导多倍体的原理
根据鱼类受精细胞学的研究，鱼类成熟卵处在第二次减数分裂中期，精子入卵受精后放出第二极体。按照生殖细胞发生和细胞分裂的机制，鱼类多倍体诱导原理如下。
1311抑制第二极体的释放
鱼类雌性配子发生中，经过染色体的加倍以后第一次减数分裂正常进行，含有二套染色体的第一极体照常排出，初级卵母细胞形成次级卵母细胞。然后继续进行第二次减数分裂，但停留在中期。此时受精刺激其继续进行分裂排出第二极体（含有一套染色体），形成具有一套染色体的卵原核。与正常的雄性原核（精子）结合形成正常的二倍体（附图1-2A）。如果在第二极体释放前，由于某些物理的或者化学的因素可以使第二极体的排出受阻，致使第二极体不能排出而与卵原核融合形成二倍体的卵原核。如果第二次减数分裂仅进行到中期即行结束，实际等于第二次减数分裂没有发生，也形成二倍体的雌性原核。由第二极体排出受阻而形成二倍体的雌性原核与正常的雄性原核（精子）结合形成三倍体个体（附图1-2B）。
通过第二极体受阻形成的三倍体称为减分II型三倍体（MII，meiosis II）。通过抑制第二极体排出诱导多倍体（三倍体）是较为成型的技术，被广泛的应用于多种水产动物的三倍体诱导之中，其中有许多企业已经利用此项技术进行商业化生产三倍体苗种。
1312抑制第一次卵裂
卵子和精子正常的结合形成正常的二倍体合子。合子形成以后很快进入卵裂期发生第一次卵裂。只要能在第一卵裂期间阻止纺锤丝的形成，使卵细胞的第一次有丝分裂成为核内有丝分裂，其结果是染色体复制，一个细胞内含双倍的二倍体染色体，由此发育为一个个体即为四倍体（附图1-2C）。抑制第一次卵裂的发生是目前诱导水产动物四倍体最为经济有效的方法。
14人工诱导多倍体产生的方法
多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，可以通过多种方法（因子）抑制极体的释放产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体。目前广泛应用的诱导方法有物理学、化学和生物学三种。
141物理学方法
受精卵的物理学处理方法已被广泛地用来抑制第二次减数分裂生产三倍体或第一次卵裂生产四倍体。主要包括温度休克、静水压力处理与电休克法等。
1411温度休克法
该方法是以改变环境温度来阻止卵母细胞正常分裂而产生多倍体。其原理是通过高温或低温温度短时间内休克（shock）细胞，使细胞中的纺锤丝被破坏。其最大的特点就是廉价、易操作，是诱导水产动物多倍体的常用手段，也适合大规模生产使用。根据处理温度的高低分为冷休克法（Cold shock）和热休克法（Heat shock）。即用略高于或低于致死温度的冷或热冲击来诱导多倍体。
（1）冷休克法。
其原理是低温能够阻止微管蛋白聚合成微管，从而阻止纺锤丝形成；纺锤丝被破坏以后则细胞不能正常分裂，极体不能形成并不能排出卵细胞。这一过程通常称为抑制极体的排放，由此可获得二倍体的卵核，将其与单倍体的精子受精即可获得三倍体。温度休克可以在第一次减数分裂期间（目前的技术只适用于某些无脊椎动物）进行（抑制第一极体的排出），也可以在第二次减数分裂中进行（抑制第二次减数分裂）。无论抑制哪一个极体的排出，均需要准确的处理时间，也就是减数分裂的中期，纺锤丝形成前和形成期间进行温度处理才能保证效果。如果诱导休克发生在第一次卵裂，则抑制了第一次卵裂的分裂过程，使卵细胞发生核内有丝分裂形成四倍体。
（2）热休克法。
若细胞处于较高温度环境中，或高温对细胞发生冲击，细胞内一些进行生命活动的重要酶类如ATP酶就会遭到破坏，从而使供能途径受阻，纺锤体不能形成，进而抑制了细胞的分裂。当将适宜的温度处理正在进行减数分裂的卵细胞时，纺锤体的破坏导致细胞分裂失败，极体不能排放，形成二倍体的卵原核，与正常精子受精即形成多倍体。热休克处理的时间与冷休克一致，即处理的时间必须刚好在减数分裂的中期以前及中期分裂纺锤丝形成期间，对于贝类可以是第一次减数分裂，也可以是第二次减数分裂；但对于鱼类目前仅对第二次减数分裂有效。如果诱导休克发生在第一次卵裂，则抑制了第一次卵裂的分裂过程，使卵细胞发生核内有丝分裂形成四倍体。
处理的温度同样因种类而异，喜冷性鱼类如鲑科鱼类宜用热休克，温度范围以不致死鱼卵或少量致死为度，多为28～36℃。而温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0～8℃，但最近研究表明，鲤鱼用热休克同样可以获得较高比例的三倍体。进行温度处理最重要的是必须确定处理的开始时间、持续时间，以及温度高低。
1412静水压处理
在天然水体中，水产动物尤其是鱼类产卵后，水位的突然变化（水深加大），导致卵所处环境的压力增大，这种静水压力适宜时，鱼卵减数分裂的纺锤丝会因压力的作用而裂解，导致二倍体卵子的形成，进而与正常精子受精得到三倍体。水压力的变化发生在第一次卵裂时，由于破坏了二倍体体细胞的纺锤丝的形成，导致类似于核内有丝分裂的现象发生则可能产生四倍体的个体。受此启发，将鱼卵采用较高的水静压处理（大约为650kg/cm2）来诱导多倍体简单易行。其原理是当细胞处于高压情况下微管所保持的结构失去原有的空间构型和刚性，微管发生可逆性裂解，破坏纺锤丝的形成，从而破坏了细胞分裂，抑制了第二极体的排出，或破坏了中期板的形成导致核内有丝分裂，进而诱导出多倍体。例如，欧洲鲶鱼受精后3min以600kg/cm2的静水压力处理鱼卵4min，结果得到978%三倍体胚胎，最后有337%的存活率；皱纹盘鲍的受精卵在受精后7min或22min分别施加650～750kg/cm2处理5min，诱发得到60%的三倍体。
静水压力处理方法的特点是诱导率较高（可达90%～100%）、处理时间短、受精卵损伤小、成活率高，但需要专门的设备—静水压力容器（图1-2），小批量生产成本较高。商业生产中多制造较大型的静水压力容器，既可保证诱导的质量，又可以批量生产，降低生产成本。目前已经商业化生产多倍体苗种的企业多数采用静水压力容器诱导方法。
图1-2静水压机
1413电脉冲休克
在一定的电场条件下，细胞与细胞之间的膜会发生融合，导致两个细胞合二为一，从而诱发多倍体（四倍体）。例如：将银大麻哈鱼受精40min后的卵置于26℃并给以10min的交流电脉冲休克处理可得到100%的三倍体。
142化学方法
一些化学物质可以破坏细胞分裂中纺锤体的形成，进而阻止卵细胞极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生多倍体。
1421秋水仙素（Colchicine，分子式：C22H25NO6·12H2O）
秋水仙素是从百合科植物秋水仙的种子、鳞茎中提取的生物碱。它能抑制微管的组装，使已有的微管解聚合，阻止纺锤体的形成或破坏已形成的纺锤体，从而导致核内有丝分裂形成多倍体细胞。在去除秋水仙素后，其作用立即结束，细胞恢复正常的生理状态。该种诱导剂在植物育种中的应用较为广泛，且有许多成功的例子。在水产动物中或其他动物中的应用较少。
1422细胞松弛素B（Cytochalasin B，分子式：C29H37NO5，简称CB）
细胞松弛素B是真菌的一类代谢产物，是水产动物育种中最常用的一种化学诱导药物。细胞松弛素B处理细胞可诱发一系列细胞学效应，如细胞骨架的变化、多核化、破坏微丝等。一般认为细胞松弛素B特异性破坏微丝，最终导致控制细胞分裂的由微丝构成的收缩环的解体，抑制细胞质分裂，阻止极体的释放，从而产生多倍体。细胞松弛素B是一种致癌物质，水溶性较差。一般用细胞松弛素B处理受精卵，将其溶解在1％的二甲基亚砜（DMSO）中配制成一定浓度的药液，处理结束后需用含1% DMSO的溶液浸洗受精卵，去除残留的细胞松弛素B。
1423聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）
聚乙二醇是一种常用的细胞融合剂，能使细胞发生融合作用，从而使染色体加倍。该药物被广泛的应用于试管内的细胞融合，如单克隆抗体的制备等方面。由于其特殊的理化特性，也将其应用于水产动物的多倍体诱导。Ueda等（1986）用聚乙二醇处理虹鳟精子，然后授精，获得了2/5的三倍体胚胎，经染色体核型分析，两套染色体来自父本，一套来自母本。证明三倍体的形成是由融合的双精子授精所致。
14246-二甲基氨基嘌呤（6-Dimethylaminopurine，分子式：C7H9N5，简称：6-DMAP）
6-二甲基氨基嘌呤是嘌呤霉素的一种类似物，其生理作用是抑制蛋白质磷酸化，通过作用于特定的酶，破坏微管的的聚合中心，使微管不能形成，从而破坏细胞分裂，抑制卵细胞极体的形成和释放。6-DMAP非致癌性，具水活性。洗除该药物后，受精卵可以正常发育。6-DMAP低毒、高效、价格便宜，在诱导多倍体方面表现出较大的优越性和较广阔的应用前景。
1425咖啡因（Caffeine）
咖啡因是一种生物碱，化学名为1，3，7-黄嘌呤，又称三丙黄嘌呤。它无色无味，存在于多种植物之中。咖啡因进入细胞后可以立即提高细胞内的Ca2+浓度，由于微管对Ca2+浓度敏感，当Ca2+浓度极低或高于10-3时，会引起微管二聚体的解聚，阻止细胞分裂，从而形成多倍体。
143生物学方法
远缘杂交、核移植及细胞融合是采用生物方法诱导鱼类多倍体的有效途径。
1431远缘杂交
在许多情况下，血缘比较远的物种之间是不能雌雄配子杂交产生后代的，有些虽然可以成功的杂交但杂种后代不育，这是因为物种间遗传基础的差异导致的。例如马和驴杂交，其后代为骡子，是严重不育的典型。杂交失败主要是配子之间不亲和性以及染色体之间配对的失衡导致的，亲本配子染色体加倍可以使染色体达到平衡，从而克服远缘杂交的困难获得多倍体的杂交种，因此，远缘杂交可以产生异源多倍体（Heterologous polyploid）。远缘杂交产生多倍体多为三倍体，但也有产生四倍体的报道。吴维新等（1988）在草鱼和红鲤的远源杂交组合中获得了数尾自然加倍的异源四倍体鱼，但是由于后代性状分化严重，在生产上没有应用价值。刘筠等（1986）自20世纪70年代以来，在鲤科鱼类的属间和不同亚科之间的远源杂交中分别获得为数众多的三倍体鱼和四倍体鱼群体。其中，在湘江野鲤（♂）× 红鲫（♀）获得F1 中发现部分可育的二倍体个体，自交获得了F2；在F2 自交后所得的第三代（F3）中发现有四倍体个体即异源四倍体鲫鲤。异源四倍体鲫鲤雌雄两性可育，遗传性状稳定，已形成了一个染色体数目为4n=200的新种。刘少军等（2007）在团头鲂（♂）× 红鲫（♀）F1 中获得了四倍体鲫鲂，四倍体鲫鲂（Ⅱ龄）达到性成熟，且雌雄两性可育。
1432核移植及细胞融合
核移植诱导鱼类多倍体技术仍处于实验阶段，试管内的细胞融合可以产生多倍体细胞，陆仁后等（1982）用四倍体的草鱼培养细胞的细胞核作为供体移植到泥鳅的去核卵内，获得心跳期的四倍体胚胎。该技术的成熟，很可能成为诱导四倍体鱼类的有效途径之一。活体体细胞之间的融合能直接产生多倍体个体，可以通过电脉冲等来实现，主要诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或者受精卵与受精卵之间的细胞融合。易泳兰等（1988）将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育得到了35%的融合鱼苗。
前面已经叙述体外用人工方法将两个精子融合后授精得到三倍体后代，人工注射两个精子代替自然受精过程也是一个生产多倍体的途径。
1433四倍体与二倍体杂交生产三倍体
目前对三倍体诱导的大量工作表明：很难有一种方法能100%的产生三倍体，且操作烦琐，每年进行诱导培育，使用昂贵的仪器，所用药品毒性大、价格昂贵，生产成本较高。四倍体与正常二倍体杂交，从理论上讲可以产生100%不育的三倍体（图1-3），从而实现大量、安全、方便、可靠的生产三倍体。该方法具有可操作性、连续性和经济性等方面的优势，是实现三倍体产业化的理想途径。这一方法首先需要获得四倍体，由于阻止第一次卵裂较阻止极体的排出难得多，因而获得四倍体的难度相对要较诱导生产三倍体大得多。目前仅在鱼类中获得了有价值的四倍体，例如虹鳟受精卵用CB处理，以及用热休克和静水压处理都获得了四倍体，用四倍体已经可以商业化生产虹鳟三倍体苗种。刘筠等用鲫和鲤交杂获得四倍体鲫鲤，然后将其与鲤鱼或鲫鱼回交获得了三倍体的杂种，分别称为湘云鲤和湘云鲫。另外已经获得奥利亚罗非鱼的四倍体个体，兴国红鲤与草鱼异源四倍体，鲢鱼的四倍体。李雅娟等（2010）利用自然四倍体泥鳅与二倍体杂交生产了杂交三倍体泥鳅。
通过四倍体与二倍体的交配生产三倍体时，多用四倍体作母本，二倍体作父本。这是因为可以保证较高的受精率。如果将四倍体作父本，则因为精子的头部较大，二倍体的卵子的受精孔较小导致受精率低下。
图1-3四倍体雌鱼与二倍体雄鱼杂交培育三倍体
15多倍体的鉴定
由于经人工处理的受精卵不能保证百分之百地成为多倍体，而且所形成的多倍体常常表现为嵌合体，因此进行染色体倍性鉴定对于确认诱导效果就显得十分必要。鉴定方法分为直接和间接两种方法。直接方法包括染色体计数和DNA含量测定等，间接方法包括细胞测量、蛋白质电泳、生化分析和形态学检查。现将常用的鉴定方法介绍如下。
151染色体计数法
通过制备染色体玻片标本后直接计数细胞中的染色体数并与正常二倍体相对照进而确定倍性的方法，是鉴定倍性最直接可靠的方法。
1511肾脏组织染色体制片法（以德国镜鲤为例）
（1）PHA和秋水仙素处理。
每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液，剂量为12μg/g（鱼/体重），18～20h后第二次注射同样剂量PHA，作用4～6h后，活体腹腔注射01%秋水仙素，溶液剂量为6μg/g（鱼体重），效应时间2～3h。
（2）取材与低渗。
配制2～4mg/kg的麻醉剂将鱼麻醉，剪尾鳍放血5～10min，取头肾剪碎于淡水生理盐水中，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，加入08%的柠檬酸三钠溶液低渗40～45min。
（3）固定。
低渗结束后，离心5min（1 000r／min）。弃上清液，放入甲醇冰醋酸=91的固定液中固定7～10min，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，转入100%冰醋酸中处理1～2min，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，再将肾组织块移入新配制预冷的卡诺固定液（甲醇冰醋酸=31）中，每隔15min更换一次固定液，重复3次，固定完毕放入青霉素小瓶中，加入新的固定液，用封口膜封口放入冰箱冷冻过夜。
（4）制片。
将固定过的样品取少量组织块于5ml小烧杯中，加入2～3滴50%冰醋酸，将组织制成细胞悬液后，加少量新配制的固定液，过滤后进行冷滴片法滴片过火，看到玻片上燃烧蓝色火焰即可。室温自然干燥。
（5）染色和镜检。
完全干燥的染色体玻片用体积分数为10%的Giemsa（pH＝68）染色液染色1～2h，蒸馏水冲洗，自然干燥。利用显微镜进行观察拍照（附图1-3）。
1512鱼类鳃细胞染色体标本制备
（1）PHA和秋水仙素处理。
用2～4mg/kg苯甲醇麻醉鱼，称重。每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液,剂量为6μg/g（鱼体重），18～20h后第二次注射同样剂量PHA，作用4～6h后，活体腹腔注射01%秋水仙素溶液，剂量为6μg/g（鱼体重），效应时间2～3h。
（2）取材。
用2～4mg/kg苯甲醇麻醉鱼，剪尾鳍放血5～10min。取鳃放入装有淡水生理盐水中的小烧杯中，不剪碎。
（3）低渗。
加入2ml 8‰的柠檬酸溶液室温下低渗40～45min。
（4）固定。
低渗后放入甲醇冰醋酸=91的固定液中固定7～10min，再转入100%冰醋酸中处理1～2min，再在常规甲醇冰醋酸=31的固定液中固定2～3次，每次15min，完毕后放入冰箱冷冻过夜。
（5）滴片。
将固定过的样品吸去固定液，加入1～2滴50%冰醋酸，用镊子将鳃丝轻轻抖动，用手术剪将鳃剪碎，制成细胞悬液后，加少量新配制的固定液，用筛绢网过滤。取预冷湿玻片一张用吸管吸取过滤后的细胞悬液，从30cm左右的高度滴到载玻片上，用口吹散滴液，置于酒精灯上过火，看到玻片上燃烧蓝色火焰即可，最后摆放到解剖盘中室温下自然风干。
（6）染色。
完全干燥的染色体玻片用pH值为74的磷酸缓冲液配制的体积分数为10%的Giemsa染色液染色1～2h，自来水冲洗，自然风干。
（7）镜检，拍照。
先在低倍镜下观察，选择染色体形态良好、分散适中的中期分裂相，然后换油镜拍照。四倍体泥鳅鳃细胞染色体相参见附图1-4。
1513胚胎细胞染色体标本制备
取发育至肌肉效应期的红鳍东方鲀的受精卵各40个，分别放入铺有琼脂糖的培养皿中，加入适量生理盐水，在解剖镜下用钟表镊子剥去卵膜、卵黄，00025%秋水仙素浸泡45min，08%柠檬酸低渗15～20min，用预冷的卡诺固定液（甲醇冰醋酸=31）重复固定3次，每次15min，冷冻（-20℃）过夜。次日吸出一个胚胎到4孔载玻片上，滴1～2滴50%冰醋酸，用黄枪头捣碎呈细胞悬液，再加入一滴预冷的卡诺固定液，用枪头混匀，吸出所有液体，进行冷滴片，过火，风干，10%吉姆萨染色30min后冲洗，风干，镜检，拍照（附图1-5）。
152核仁银染法（Ag-NORs）
细胞的核仁数目与倍性有关，在正常情况下，单倍体细胞含一个核仁，二、三、四倍体细胞分别含二、三、四个核仁。在多倍体鱼类的倍性鉴定中，银染核仁组织区法与其他多倍体鱼类的倍性检测方法相比，不但快捷准确而且省时省力，无须特殊的仪器,在条件相当简陋的实验室就可以进行操作，是值得推广的一种好方法。
具体操作方法主要参照Howell and Black（1980）的快速银染法并略加修改。50%AgNO3与明胶溶液21在染色体片子上混合，加盖玻片，70℃恒温箱中处理2～3min，用70℃去离子水冲洗，自然干燥；干燥后显微镜下观察，拍照（图1-4）。
图1-4德国镜鲤间期细胞核Ag-NORs 标尺示10μm
153细胞核体积测量法
同一研究对象的二倍体和多倍体个体，其细胞核及细胞大小不同。二倍体与三倍体、四倍体血红细胞核体积预期比值为1152。
红细胞测量的具体操作简单。以泥鳅为例（附图1-6）。
（1）血涂片的制备。麻醉鱼采用一次性注射器从实验鱼尾部静脉处采血，涂片后用甲醇固定3～5min，吉姆萨染液染色5min。
（2）镜检拍照。先用低倍镜下观察，找到细胞分散均匀、不重叠、不变形的视野，换高倍镜观察后用数码显微拍照。并在同样倍数下拍台微尺。
（3）用Adobe Photoshop软件测量。计算核体积=4/3πab2或=ab2/191，式中a—为长半轴，b—为短半轴。
154极体计数法
极体计数法已作为一种简单快速的方法用于早期胚胎三倍体的检测（Beaumont等，1986）。观察鱼类极体释放的具体方法是将受精卵用波恩固定液固定后，用刀片将卵黄切除，依常规方法脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，染色（一种是用DAPI染色，另一种是苏木精，曙红双重染色）以后步骤与正常的组织切片相同（附图1-7）。
155DNA含量测定方法
细胞核内的DNA含量与它们所含的染色体数成比例，当细胞内染色体倍数增加时，其DNA含量也相应增加，所以可以通过DNA含量来确定染色体数目的多少。
1551流式细胞仪
用流式细胞仪测定细胞DNA含量具体方法（以泥鳅为例）。
（1）机械法。剪取约5mm×5mm大小的尾鳍,放置于干净的小培养皿中,用刀片将尾鳍剁碎；将剁碎的样品转入样品管中,加入DAPI染液,用SK-1快速混匀仪振荡10～15s,使细胞脱落游离；用300～500目小筛网过滤混悬液到测试小管中,制得细胞悬液,使样品管液体体积最终在15～2ml,样品细胞的最终浓度为105～106个/ml。
（2）抽取血液法。用经肝素润湿的一次性注射器在尾静脉抽血002～003ml，注入加有1ml淡水生理盐水的离心管中，轻轻摇动使血液混匀；用滴管抽取血液混合液一滴到测试小管中，加入10～15mlDAPI染液,上机进行测试。检测结果以DNA直方图的形式表示，图中横坐标代表DNA的相对含量，纵坐标代表细胞频率。从图中可看出三倍体泥鳅的DNA含量是二倍体泥鳅DNA含量的15倍；四倍体泥鳅的DNA含量是二倍体泥鳅DNA含量的2倍（图1-5）。
A:二倍体；B：三倍体；C：四倍体
图1-5泥鳅流式细胞仪倍性检测结果
1552显微荧光测定法
将被测材料用固定液固定后，将组织用细胞匀浆仪弄碎，使细胞游离制成涂片标本，或者采取血液制成血涂片固定。标本用DAPI染色，然后在显微分光光度计，通过365nm长的紫外线，用扫描测光装置测定细胞核的荧光强度，获得处理组个体和对照组个体之间细胞核DNA相对含量曲线，从而测出二者的DNA比率，即可确定处理组个体的倍性，进而计算出三倍体的诱发率。
16多倍体的生物学特性
161性腺发育
人工诱导的三倍体鱼类预期是不育的，因为奇数染色体组将导致减数分裂姊妹染色体配对的不平衡而不能进行，由此引发性腺发育的受阻或非整倍体配子的产生，已有许多研究证明了这一点。如诱发尼罗罗非鱼三倍体雌雄皆为不育；三倍体草鱼和三角鲂杂种的雌性完全不育，雄性个体的生殖细胞只能发育到精原细胞阶段，也为不育；三倍体的鲤鱼性腺不能发育；黑鲷三倍体性腺明显小于二倍体，即使2～4龄的性腺能产生精子但其形态异常且浓度较低。一般三倍体雄鱼比三倍体雌鱼呈现较好的性腺发育。
四倍体个体的性腺发育正常，但育性较二倍体表现差。李建中等（2002）采用组织切片技术对异源四倍体鲫鲤的性腺进行研究，结果表明，异源四倍体鲫鲤的性腺发育是正常的，雌雄个体都能达到性成熟。两性可育并遗传稳定的四倍体鱼为探讨自然界鱼类多倍体形成机制提供了重要的理论依据，为鱼类多倍体育种提供了新的途径。
162生活力与生长
大多数学者的研究发现，人工诱导的三倍体鱼类具有正常的生活力。如三棘刺鱼、鲽与川鲽杂种、奥利亚罗非鱼、鲤、草鱼以及斑马鱼等的生活力与同种的二倍体没有明显的区别。但也有例外，如虹鳟和银大麻哈鱼等人工诱导三倍体的生活力比二倍体差一些。
在早期生长上，有的三倍体鱼要比二倍体快。吴清江等（1979）用红鲤×镜鲤得到的三倍体孵出的8个月内体重比二倍体重26～263倍。三倍体奥利亚罗非鱼14周时，其个体比二倍体鱼个体大。但更多的研究表明三倍体和二倍体两者在早期生长方面无明显差异。还有例子表明三倍体鱼的生长低于二倍体。
163其他性状
经过对鱼肉质量、含氧量、抗病性和感觉特性等性状的研究发现三倍体虹鳟的鱼肉质量优于二倍体；三倍体大西洋鲑需氧能力低于二倍体，故可适于低氧环境养殖；三倍体香鱼的抗病力与二倍体无明显差异。
多数情况下三倍体的个体不比二倍体大，这必然伴随三倍体个体细胞数量的减少，同时也伴随各个器官细胞数量的减少。脑细胞数量的减少导致三倍体的智力可能比二倍体低下，这有可能使三倍体的竞争力较低。同样分泌器官细胞数量的减少也可能使调节免疫力等的物质的分泌量减少，如激素等。
17多倍体的应用
171提高生长速度
由于三倍体不需要消耗能量用于生殖腺发育，可将所有的能量用于生长，故三倍体的生长速度在性成熟期间及以后会具有生长优势。从水产养殖角度出发，人工诱导三倍体的兴趣多半是寄希望于三倍体会比二倍体生长得更快，其生长情况因种类和发育阶段而异。研究发现，在性成熟时，三倍体普遍比二倍体生长快。三倍体鱼早期生长与二倍体相比没有什么优势，但到了产卵期，其生长速度明显快。生物的生长往往在性成熟以后会停滞或大幅度的减慢，有人期望三倍体因性腺不发育，因此也就不会停止身体的生长，这样养殖生产即可以获得较大个体的养殖对象，例如，期望大麻哈等鱼类的三倍体可以生长到金枪鱼那样大小。
172控制过度繁殖
三倍体鱼类的性腺不发育，所以不会产生后代，这为三倍体的生物学利用提供了广泛的空间。可以用养殖不育的群体控制养殖密度，例如罗非鱼的繁殖能力较强，且一年数次产卵，导致养殖水体中数代同塘，个体大小非常不匀，放养三倍体则不会产生此类问题。用三倍体群体完成一些短期的目标，目标完成以后群体也自然消亡，如在杂草丛生的水体放养不育的草鱼三倍体既能除草又可防止因其繁育后代导致的生态变化。此项技术在鲍鱼、珍珠贝上效果也特别明显。
173延长寿命
对于那些在性成熟时会遭受损失或有成熟死亡的鱼类来说，不育三倍体可能比二倍体存活得更长久。在鲑鳟鱼类中如虹鳟在缺乏产卵支流的湖泊中会有很高的死亡率，又如大麻哈鱼等降海的鲑科鱼类一生产卵一次，产卵后通常死亡（成熟死亡），而三倍体大麻哈鱼就不存在这种情况，它的性腺不发育，因此就不会性成熟，也就不会因性成熟而发生成熟死亡。香鱼和公鱼的寿命很短，一般是在秋季产卵繁殖，而后结束其一生，而三倍体香鱼可以跨年生长，还可以全年上市销售。
174改善品质
三倍体物种的细胞体积大，因此同样大小的二倍体和三倍体，三倍体的细胞数量要少于二倍体，相对的筋膜等也少于二倍体，并且三倍体的鱼肉看起来较有光泽，因此三倍体个体的肌肉的口感柔软，更受消费者的偏爱。Wolters等（1982）认为，三倍体斑点叉尾具有比二倍体小的头部，这样净肉率高于二倍体，在加工过程中浪费较少。三倍体香鱼的鱼片厚度平均比二倍体高；三倍体和二倍体鲽与川鲽杂种也有同样情况。
性成熟的动物往往伴随着肌肉质量的下降，动物生产中采取阉割的办法避免肌肉质量下降。对于那些无法采用阉割技术的动物，则在性成熟前上市保证肌肉的品质。所以欧美国家消费虹鳟等鱼类时，偏好个体较小的未成熟个体。三倍体的鱼类因性腺不发育，生长中没有肌肉质量下降的问题。
18多倍体泥鳅研究现状
泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是广泛分布在中国大陆、朝鲜半岛、日本列岛、台湾等地的鲤形目、鳅科、泥鳅属的小型淡水鱼类（斉藤憲治，1989）。泥鳅肉质鲜美，营养丰富，富含蛋白质及多种维生素，并具有药用价值，被誉为“水中人参”（刘孝华，2008）。泥鳅具有广阔的市场前景（谷士荣，2011），在我国南北各地，泥鳅作为滋补佳品早已摆上家庭、酒店的餐桌，日本和韩国人视其为高档营养食品，更是畅销不已。据国内外泥鳅市场调查显示，从2001年至今，连续走俏市场。价格连年攀升。但由于多年的过度捕捞，自然水域生态环境日益恶化，我国野生泥鳅的产量正逐渐降低，泥鳅已经成为我国目前主要的养殖品种。随着养殖规模的逐渐扩大，高产、高效的优良品种已成为泥鳅养殖业发展的瓶颈之一。三倍体鱼类以其育性差、生长快等特性而成为鱼类遗传育种研究的热点。因此，规模化培育三倍体泥鳅，对促进泥鳅养殖生产的发展，将具有重要的经济价值和广阔的应用前景。
泥鳅的倍性一直受国内外学者所关注。国外主要集中在日本，1979年，日本学者Ojima和Takai（1979）首次在野生群体的泥鳅样本中发现染色体数为2n=50的二倍体、3n=75的三倍体和来自水产品市场的（来源不明）4n=100的四倍体个体。Arai研究室历经20多年对日本产自然三倍体及起源不明的四倍体（来源市场）进行了系统的研究。发现日本除正常有性生殖的二倍体泥鳅外，还存在无性生殖二倍体和杂种生殖的三倍体，但没有发现自然四倍体（Morishima K et al.，2002；Arai K et al.，1991；Zhang Q et al.，1999；荒井克俊，2004）。日本产三倍体是由于同一栖息场所的二倍体泥鳅产生二倍体未减数卵与精子偶尔受精形成的，这些未减数的二倍体卵，精子不参与通过雌核发育进行繁殖。因此，把这种二倍体称为无性生殖二倍体，经细胞学研究表明，无性生殖二倍体的未减数卵的细胞学机制是减数分裂前核内有丝分裂（荒井克俊，2004）。并通过线粒体DNA序列及微卫星分析进一步证明了日本泥鳅分为两个不同的种类，无性生殖二倍体是由两个不同种间泥鳅杂交形成的（Kagayaki Morishima et al.，2008）。通常人工诱导的三倍体无论雌雄都不育，而日本产自然三倍体雄的不育，雌的可以产生单倍体（1n）和三倍体（3n）卵。并证实了起源不明的四倍体是遗传的四倍体（2n=100），同时利用起源不明的四倍体通过人工繁殖实验及染色体操作培育出三倍体、四倍体、五倍体及六倍体，并对其后代的染色体数目、成活率等生殖特性进行了详细的研究（荒井克俊，2009）。
我国关于自然多倍体泥鳅的研究以往报道较少。主要集中在四倍体核型（李康等，1983；李渝成等，1987；印杰等，2005）、倍性鉴定（李雅娟等，2008；高泽霞等，2007；郭伟荣等，2009）、细胞色素b基因序列（Yang C et al.，2009）、群体遗传结构（周玲玲等，2011）、线粒体基因多态性（郑鹏飞等，2011）等研究上。本书著者从2004—2011年与日本北海道大学荒井克俊教授进行了合作研究。为探讨中国天然多倍体泥鳅的分布、起源及形成机制，对中国泥鳅线粒体DNA序列分析、自然多倍体的分布、体细胞染色体核型分析、染色体带型和FISH研究、减数分裂染色体行为、人工诱导雌核发育及生殖特性等方面进行了系统的研究。初次证实了我国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体(4n=100)、是同源四倍体、能产生正常的2n配子（雌或雄）。2012—2016年李雅娟主持的国家自然科学基金项目“泥鳅杂交三倍体染色体组稳定性及其表观遗传机制解析（31272650）”首次利用天然四倍体泥鳅与二倍体杂交制备了1种新型的杂交三倍体，并对早期的染色体数目、DNA含量、生殖特性、减数分裂行为、性腺发育及表观遗传机制等进行了研究。从表观遗传学的角度对杂交三倍体泥鳅及其亲本DNA甲基化水平差异和关键基因的甲基化调控机制进行分析，探索杂交三倍体优势性状的表观遗传机理。从而促进杂交三倍体泥鳅杂种优势的形成。为今后鱼类三倍体杂种优势形成机理提供理论与技术支持。为我国三倍体鱼类的产业化探索高效易行的新途径奠定基础。
第2章中国自然多倍体泥鳅的分布、染色体核型及形态特征
文摘
第1章绪论
11鱼类染色体的多倍性
一个物种细胞中染色体形态结构和数目的恒定性是这个种的重要特征。二倍体生物在有性繁殖过程中，或者是生物体世代交替中，能维持配子正常功能的、最低数目的一套染色体（chromosome set）称为染色体组或基因组（genome）。进行有性生殖的生物把含有2套染色体组的称为二倍体（diploid，2n），含有3套、4套染色体组的生物分别称为3倍体（triploid,3n）和4倍体（tetraploid,4n）。多倍体（Polyploid）最早是由德国学者Winkler（1916）诱发植物多倍体成功后首先提出来的。它是指生物体体细胞中含有3套或3套以上染色体组的个体。由于多倍体生物具有比二倍体多出一倍或以上的基因和复等位基因的变异，所以拥有更高的代谢能力和物质合成能力。多倍化是生物进化变异的自然现象，也是促进生物发生进化改变的重要力量。据不完全统计，植物界中被子植物有30％～80%是多倍体，大约70%显花植物在进化过程中进行多倍化。但动物中的多倍体现象比较少。在低等动物中，如甲壳类中的盐水丰年虾为四倍体；线形动物中的马蛔虫为同源四倍体（4n=4）。昆虫中的多倍体现象又总是与孤雌生殖方式联系在一起。在水产动物中，多倍体现象比较普遍。世界上现存鱼类约有2万多种，已研究过染色体的鱼类约有1 100余种，其中多倍体至少有60种（桂建芳，1985；马纲，1996）。许多多倍体种类是重要的经济鱼类或重要的养殖对象。例如鲑科的虹鳟、白鲑、各种大麻哈鱼和茴鱼是四倍体；胭脂鱼科中几乎所有的种类都是四倍体；鲫鱼的变种—金鱼中除了四倍体外，还有三倍体如银金鱼。此外，还有四倍体的泥鳅和三倍体的花鳟鱼、鲫鱼等。开展鱼类自然多倍体的研究，对查明我国多倍体鱼类资源及合理开发利用这些资源具有十分重要的意义。
从来源上分析，如果加倍的染色体来自于同一物种或在原有染色体组的基础上加倍而成，则称为同源多倍体（homologous polyploid）（图1-1），如虹鳟鱼的受精卵用温度休克处理抑制第一次有丝分裂进而获得虹鳟鱼同源四倍体，其子代的染色体完全来源于同一物种虹鳟。如果加倍的染色体来源于不同的物种，则称为异源多倍体（heterologous polyploid）（图1-1），如用白鲫（2n=100）为母本，红鲤（2n=100）为父本进行属间杂交，受精卵再经温度休克处理抑制第一次有丝分裂使染色体加倍，结果获得四倍体鲤鲫杂种鱼苗（4n=200），其中父母本的染色体各占一半。
注：直线表示杂交；粗箭头表示染色体加倍；A、B代表染色体组
图1-1同源与异源四倍体形成过程
12鱼类自然多倍体形成机制
121体细胞染色体加倍
体细胞在有丝分裂中期发生分裂异常现象（核内有丝分裂、核内复制或分裂后两个子细胞的融合）导致染色体加倍分裂失败，形成染色体数目加倍的多倍体细胞，进而形成一定的多倍体组织或器官。所谓核内有丝分裂（endomitosis），是体细胞在正常有丝分裂中，染色体复制一次，但至分裂中期，核膜没有破裂、消失，也无纺锤丝的形成，当然也不会发生细胞分裂中后期的细胞质分裂，因此每个染色体形成四条染色体，称为双倍染色体（diplochromosome），这时染色体两两平行排列在一起，结果形成的细胞是四倍体。其后经过正常的细胞分裂，形成两个子细胞均为四倍体。这一过程发生在受精卵的第一次有丝分裂，即形成四倍体个体，若发生在性腺细胞则产生二倍体的配子，与二倍体交配则产生三倍体。日本北海道女满别街存在高频率的三倍体，经细胞遗传学研究三倍体是由同一栖息场所的二倍体泥鳅产生二倍体未减数卵与精子偶尔受精形成的，这些未减数的二倍体卵，精子不参与通过雌核发育进行繁殖。因此，把这种二倍体称为无性生殖二倍体，经细胞学研究表明，无性生殖二倍体的未减数卵的细胞学机制是减数分裂前核内有丝分裂，其原理如附图1-1所示。这种多倍体的组织或器官在动物和植物都可能出现，但动物和植物体上的发育结果是有明显差别的。动物体细胞染色体加倍后一般体细胞不能进行无性生殖而传留，只有当染色体加倍的细胞是生殖细胞时，这种变异才有可能传留，而且要求这一变异的个体恰好遇到了发生同一变异的异性，并有机会交配生殖才能有可能传留后代；同时，多倍体的动物因为生殖生物学方面的原因会遇到不育或育性不良的现象，因此动物多倍体传留后代的机会很少。
122生殖细胞的异常减数分裂
由于某种原因生殖细胞的同源染色体或姐妹染色单体在后期没有分开，二组染色体进入到同一配子中，导致配子中染色体数目的加倍形成2n配子。这样的配子经授精后形成倍性不同于亲代的多倍体，如三倍体、四倍体等，但其子代的可育性很低。从现有对多倍体细胞减数分裂研究结果看，奇数性动物多倍体中能形成的平衡配子的数目都极少。同源三倍体在减数分裂的后期，无论配成是一个双价体和一个单价体，还是配成一个三价体，平衡配子的类型只有二种，一种是n条染色体的配子,另一种是2n条染色体的配子，这两种类型的配子都是可育配子（平衡配子）。当所有的染色体都是每一条都进入同一极，则形成具有n条染色体的配子，其概率为（1/2）的n 次方，同时另一极则具有2n条染色体，也是可育配子，即同时产生2个可育配子，因此由（1/2）的n次方乘以2，这样就等于（1/2）的n-1次方（刘祖洞，1990），如3n的个体，只有（1/2）n-1个平衡配子。高等动物中，虽然雄配子一次产生的数量较多，但雌性个体一次产生的雌配子数目较少，因此，高等动物中能够形成平衡多倍体子代的可能性当然也就极小，实际存在的多倍体种类也就比较少（叶名文，1998）。
123双（多）精受精
在一些鱼类中是精子产生雄配子素Ⅱ，溶解卵膜孔的卵膜形成受精孔。卵子的卵膜孔区有两种雌配子素，雌配子素Ⅰ有吸引和加速精子活动的作用，一个精子进入卵子以后立即释放雌配子素Ⅱ，雌配子素II封闭卵膜孔，并有破坏被吸引到卵的表面而不能进入卵的精子的作用。因此，动物的受精机制保证只有一个精子进入卵子受精（叶富良，2002）。由于雌、雄配子素的共同作用，最终使1个精子的头部由卵膜孔入卵，实现精卵两核的融合。当卵子的受精孔由于某些生理的或自然的原因不能及时封闭时，则可能有两个或多个精子进入卵子，并同时完成受精过程，进而形成三倍体（双精）、四倍体（三精）的合子而发育形成多倍体个体。这种双精入卵的生物学现象在植物中、动物中，以及高等动物中均有发现。在自然界中靠自然力量形成多倍体的机制，目前还没有通过该种方法人工诱导多倍体的先例。
124远缘杂交
不同二倍体物种之间杂交，当杂交的两个物种血缘关系较远，会产生杂交种不育现象；当血缘关系比较近时形成异缘二倍体杂交种，如鲤鱼和鲫鱼杂交得到的大鳞鲤是异源二倍体；如果遗传基础差异较大，杂交很难获得二倍体杂种，但有时远缘杂交可以导致远缘多倍体的形成，这一现象在鱼类等水产动物的远缘杂交中经常出现，尤其是附以一定的技术手段处理后更加容易获得异源多倍体。
125个体发育调节机制
动物体中，染色体、神经、体液调节的存在，对配子的产生、合子的形成、性别的决定和子代个体的发育有重要影响。多倍体动物之所以稀少，可能与染色体的性别决定有关。任何多于二倍体的染色体都容易造成动物的高度不育。如XY型性别决定中，当染色体加倍时，一个雄性二倍体加倍而成的四倍体，其性细胞的染色体组成为XXYY，产生的配子所含性染色体为XY，一个雌的二倍体加倍形成的四倍体，其性细胞的染色体组成为XXXX，产生的配子所含性染色体为XX。这两种配子受精，形成XXXY合子，既不是完全的雌性，也不是完全的雄性，因而是不育的。
13鱼类多倍体诱导
131人工诱导多倍体的原理
根据鱼类受精细胞学的研究，鱼类成熟卵处在第二次减数分裂中期，精子入卵受精后放出第二极体。按照生殖细胞发生和细胞分裂的机制，鱼类多倍体诱导原理如下。
1311抑制第二极体的释放
鱼类雌性配子发生中，经过染色体的加倍以后第一次减数分裂正常进行，含有二套染色体的第一极体照常排出，初级卵母细胞形成次级卵母细胞。然后继续进行第二次减数分裂，但停留在中期。此时受精刺激其继续进行分裂排出第二极体（含有一套染色体），形成具有一套染色体的卵原核。与正常的雄性原核（精子）结合形成正常的二倍体（附图1-2A）。如果在第二极体释放前，由于某些物理的或者化学的因素可以使第二极体的排出受阻，致使第二极体不能排出而与卵原核融合形成二倍体的卵原核。如果第二次减数分裂仅进行到中期即行结束，实际等于第二次减数分裂没有发生，也形成二倍体的雌性原核。由第二极体排出受阻而形成二倍体的雌性原核与正常的雄性原核（精子）结合形成三倍体个体（附图1-2B）。
通过第二极体受阻形成的三倍体称为减分II型三倍体（MII，meiosis II）。通过抑制第二极体排出诱导多倍体（三倍体）是较为成型的技术，被广泛的应用于多种水产动物的三倍体诱导之中，其中有许多企业已经利用此项技术进行商业化生产三倍体苗种。
1312抑制第一次卵裂
卵子和精子正常的结合形成正常的二倍体合子。合子形成以后很快进入卵裂期发生第一次卵裂。只要能在第一卵裂期间阻止纺锤丝的形成，使卵细胞的第一次有丝分裂成为核内有丝分裂，其结果是染色体复制，一个细胞内含双倍的二倍体染色体，由此发育为一个个体即为四倍体（附图1-2C）。抑制第一次卵裂的发生是目前诱导水产动物四倍体最为经济有效的方法。
14人工诱导多倍体产生的方法
多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，可以通过多种方法（因子）抑制极体的释放产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体。目前广泛应用的诱导方法有物理学、化学和生物学三种。
141物理学方法
受精卵的物理学处理方法已被广泛地用来抑制第二次减数分裂生产三倍体或第一次卵裂生产四倍体。主要包括温度休克、静水压力处理与电休克法等。
1411温度休克法
该方法是以改变环境温度来阻止卵母细胞正常分裂而产生多倍体。其原理是通过高温或低温温度短时间内休克（shock）细胞，使细胞中的纺锤丝被破坏。其最大的特点就是廉价、易操作，是诱导水产动物多倍体的常用手段，也适合大规模生产使用。根据处理温度的高低分为冷休克法（Cold shock）和热休克法（Heat shock）。即用略高于或低于致死温度的冷或热冲击来诱导多倍体。
（1）冷休克法。
其原理是低温能够阻止微管蛋白聚合成微管，从而阻止纺锤丝形成；纺锤丝被破坏以后则细胞不能正常分裂，极体不能形成并不能排出卵细胞。这一过程通常称为抑制极体的排放，由此可获得二倍体的卵核，将其与单倍体的精子受精即可获得三倍体。温度休克可以在第一次减数分裂期间（目前的技术只适用于某些无脊椎动物）进行（抑制第一极体的排出），也可以在第二次减数分裂中进行（抑制第二次减数分裂）。无论抑制哪一个极体的排出，均需要准确的处理时间，也就是减数分裂的中期，纺锤丝形成前和形成期间进行温度处理才能保证效果。如果诱导休克发生在第一次卵裂，则抑制了第一次卵裂的分裂过程，使卵细胞发生核内有丝分裂形成四倍体。
（2）热休克法。
若细胞处于较高温度环境中，或高温对细胞发生冲击，细胞内一些进行生命活动的重要酶类如ATP酶就会遭到破坏，从而使供能途径受阻，纺锤体不能形成，进而抑制了细胞的分裂。当将适宜的温度处理正在进行减数分裂的卵细胞时，纺锤体的破坏导致细胞分裂失败，极体不能排放，形成二倍体的卵原核，与正常精子受精即形成多倍体。热休克处理的时间与冷休克一致，即处理的时间必须刚好在减数分裂的中期以前及中期分裂纺锤丝形成期间，对于贝类可以是第一次减数分裂，也可以是第二次减数分裂;但对于鱼类目前仅对第二次减数分裂有效。如果诱导休克发生在第一次卵裂，则抑制了第一次卵裂的分裂过程，使卵细胞发生核内有丝分裂形成四倍体。
处理的温度同样因种类而异，喜冷性鱼类如鲑科鱼类宜用热休克，温度范围以不致死鱼卵或少量致死为度，多为28～36℃。而温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0～8℃，但最近研究表明，鲤鱼用热休克同样可以获得较高比例的三倍体。进行温度处理最重要的是必须确定处理的开始时间、持续时间，以及温度高低。
1412静水压处理
在天然水体中，水产动物尤其是鱼类产卵后，水位的突然变化（水深加大），导致卵所处环境的压力增大，这种静水压力适宜时，鱼卵减数分裂的纺锤丝会因压力的作用而裂解，导致二倍体卵子的形成，进而与正常精子受精得到三倍体。水压力的变化发生在第一次卵裂时，由于破坏了二倍体体细胞的纺锤丝的形成，导致类似于核内有丝分裂的现象发生则可能产生四倍体的个体。受此启发，将鱼卵采用较高的水静压处理（大约为650kg/cm2）来诱导多倍体简单易行。其原理是当细胞处于高压情况下微管所保持的结构失去原有的空间构型和刚性，微管发生可逆性裂解，破坏纺锤丝的形成，从而破坏了细胞分裂，抑制了第二极体的排出，或破坏了中期板的形成导致核内有丝分裂，进而诱导出多倍体。例如，欧洲鲶鱼受精后3min以600kg/cm2的静水压力处理鱼卵4min，结果得到978%三倍体胚胎，最后有337%的存活率；皱纹盘鲍的受精卵在受精后7min或22min分别施加650～750kg/cm2处理5min，诱发得到60%的三倍体。
静水压力处理方法的特点是诱导率较高（可达90%～100%）、处理时间短、受精卵损伤小、成活率高，但需要专门的设备—静水压力容器（图1-2），小批量生产成本较高。商业生产中多制造较大型的静水压力容器，既可保证诱导的质量，又可以批量生产，降低生产成本。目前已经商业化生产多倍体苗种的企业多数采用静水压力容器诱导方法。
图1-2静水压机
1413电脉冲休克
在一定的电场条件下，细胞与细胞之间的膜会发生融合，导致两个细胞合二为一，从而诱发多倍体（四倍体）。例如：将银大麻哈鱼受精40min后的卵置于26℃并给以10min的交流电脉冲休克处理可得到100%的三倍体。
142化学方法
一些化学物质可以破坏细胞分裂中纺锤体的形成，进而阻止卵细胞极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生多倍体。
1421秋水仙素（Colchicine，分子式：C22H25NO6·12H2O）
秋水仙素是从百合科植物秋水仙的种子、鳞茎中提取的生物碱。它能抑制微管的组装，使已有的微管解聚合，阻止纺锤体的形成或破坏已形成的纺锤体，从而导致核内有丝分裂形成多倍体细胞。在去除秋水仙素后，其作用立即结束，细胞恢复正常的生理状态。该种诱导剂在植物育种中的应用较为广泛，且有许多成功的例子。在水产动物中或其他动物中的应用较少。
1422细胞松弛素B（Cytochalasin B，分子式：C29H37NO5，简称CB）
细胞松弛素B是真菌的一类代谢产物，是水产动物育种中最常用的一种化学诱导药物。细胞松弛素B处理细胞可诱发一系列细胞学效应，如细胞骨架的变化、多核化、破坏微丝等。一般认为细胞松弛素B特异性破坏微丝，最终导致控制细胞分裂的由微丝构成的收缩环的解体，抑制细胞质分裂，阻止极体的释放，从而产生多倍体。细胞松弛素B是一种致癌物质，水溶性较差。一般用细胞松弛素B处理受精卵，将其溶解在1％的二甲基亚砜（DMSO）中配制成一定浓度的药液，处理结束后需用含1% DMSO的溶液浸洗受精卵，去除残留的细胞松弛素B。
1423聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）
聚乙二醇是一种常用的细胞融合剂，能使细胞发生融合作用，从而使染色体加倍。该药物被广泛的应用于试管内的细胞融合，如单克隆抗体的制备等方面。由于其特殊的理化特性，也将其应用于水产动物的多倍体诱导。Ueda等（1986）用聚乙二醇处理虹鳟精子，然后授精，获得了2/5的三倍体胚胎，经染色体核型分析，两套染色体来自父本，一套来自母本。证明三倍体的形成是由融合的双精子授精所致。
14246-二甲基氨基嘌呤（6-Dimethylaminopurine，分子式：C7H9N5，简称：6-DMAP）
6-二甲基氨基嘌呤是嘌呤霉素的一种类似物，其生理作用是抑制蛋白质磷酸化，通过作用于特定的酶，破坏微管的的聚合中心，使微管不能形成，从而破坏细胞分裂，抑制卵细胞极体的形成和释放。6-DMAP非致癌性，具水活性。洗除该药物后，受精卵可以正常发育。6-DMAP低毒、高效、价格便宜，在诱导多倍体方面表现出较大的优越性和较广阔的应用前景。
1425咖啡因（Caffeine）
咖啡因是一种生物碱，化学名为1，3，7-黄嘌呤，又称三丙黄嘌呤。它无色无味，存在于多种植物之中。咖啡因进入细胞后可以立即提高细胞内的Ca2+浓度，由于微管对Ca2+浓度敏感，当Ca2+浓度极低或高于10-3时，会引起微管二聚体的解聚，阻止细胞分裂，从而形成多倍体。
143生物学方法
远缘杂交、核移植及细胞融合是采用生物方法诱导鱼类多倍体的有效途径。
1431远缘杂交
在许多情况下，血缘比较远的物种之间是不能雌雄配子杂交产生后代的，有些虽然可以成功的杂交但杂种后代不育，这是因为物种间遗传基础的差异导致的。例如马和驴杂交，其后代为骡子，是严重不育的典型。杂交失败主要是配子之间不亲和性以及染色体之间配对的失衡导致的，亲本配子染色体加倍可以使染色体达到平衡，从而克服远缘杂交的困难获得多倍体的杂交种，因此，远缘杂交可以产生异源多倍体（Heterologous polyploid）。远缘杂交产生多倍体多为三倍体，但也有产生四倍体的报道。吴维新等（1988）在草鱼和红鲤的远源杂交组合中获得了数尾自然加倍的异源四倍体鱼，但是由于后代性状分化严重，在生产上没有应用价值。刘筠等（1986）自20世纪70年代以来，在鲤科鱼类的属间和不同亚科之间的远源杂交中分别获得为数众多的三倍体鱼和四倍体鱼群体。其中，在湘江野鲤（♂）× 红鲫（♀）获得F1 中发现部分可育的二倍体个体，自交获得了F2；在F2 自交后所得的第三代（F3）中发现有四倍体个体即异源四倍体鲫鲤。异源四倍体鲫鲤雌雄两性可育，遗传性状稳定，已形成了一个染色体数目为4n=200的新种。刘少军等（2007）在团头鲂（♂）× 红鲫（♀）F1 中获得了四倍体鲫鲂，四倍体鲫鲂（Ⅱ龄）达到性成熟，且雌雄两性可育。
1432核移植及细胞融合
核移植诱导鱼类多倍体技术仍处于实验阶段，试管内的细胞融合可以产生多倍体细胞，陆仁后等（1982）用四倍体的草鱼培养细胞的细胞核作为供体移植到泥鳅的去核卵内，获得心跳期的四倍体胚胎。该技术的成熟，很可能成为诱导四倍体鱼类的有效途径之一。活体体细胞之间的融合能直接产生多倍体个体，可以通过电脉冲等来实现，主要诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或者受精卵与受精卵之间的细胞融合。易泳兰等（1988）将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育得到了35%的融合鱼苗。
前面已经叙述体外用人工方法将两个精子融合后授精得到三倍体后代，人工注射两个精子代替自然受精过程也是一个生产多倍体的途径。
1433四倍体与二倍体杂交生产三倍体
目前对三倍体诱导的大量工作表明：很难有一种方法能100%的产生三倍体，且操作烦琐，每年进行诱导培育，使用昂贵的仪器，所用药品毒性大、价格昂贵，生产成本较高。四倍体与正常二倍体杂交，从理论上讲可以产生100%不育的三倍体（图1-3），从而实现大量、安全、方便、可靠的生产三倍体。该方法具有可操作性、连续性和经济性等方面的优势，是实现三倍体产业化的最好途径。这一方法首先需要获得四倍体，由于阻止第一次卵裂较阻止极体的排出难得多，因而获得四倍体的难度相对要较诱导生产三倍体大得多。目前仅在鱼类中获得了有价值的四倍体，例如虹鳟受精卵用CB处理，以及用热休克和静水压处理都获得了四倍体，用四倍体已经可以商业化生产虹鳟三倍体苗种。刘筠等用鲫和鲤交杂获得四倍体鲫鲤，然后将其与鲤鱼或鲫鱼回交获得了三倍体的杂种，分别称为湘云鲤和湘云鲫。另外已经获得奥利亚罗非鱼的四倍体个体，兴国红鲤与草鱼异源四倍体，鲢鱼的四倍体。李雅娟等（2010）利用自然四倍体泥鳅与二倍体杂交生产了杂交三倍体泥鳅。
通过四倍体与二倍体的交配生产三倍体时，多用四倍体作母本，二倍体作父本。这是因为可以保证较高的受精率。如果将四倍体作父本，则因为精子的头部较大，二倍体的卵子的受精孔较小导致受精率低下。
图1-3四倍体雌鱼与二倍体雄鱼杂交培育三倍体
15多倍体的鉴定
由于经人工处理的受精卵不能保证百分之百地成为多倍体，而且所形成的多倍体常常表现为嵌合体，因此进行染色体倍性鉴定对于确认诱导效果就显得十分必要。鉴定方法分为直接和间接两种方法。直接方法包括染色体计数和DNA含量测定等，间接方法包括细胞测量、蛋白质电泳、生化分析和形态学检查。现将常用的鉴定方法介绍如下。
151染色体计数法
通过制备染色体玻片标本后直接计数细胞中的染色体数并与正常二倍体相对照进而确定倍性的方法，是鉴定倍性最直接可靠的方法。
1511肾脏组织染色体制片法（以德国镜鲤为例）
（1）PHA和秋水仙素处理。
每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液，剂量为12μg/g（鱼/体重），18～20h后第二次注射同样剂量PHA，作用4～6h后，活体腹腔注射01%秋水仙素，溶液剂量为6μg/g（鱼体重），效应时间2～3h。
（2）取材与低渗。
配制2～4mg/kg的麻醉剂将鱼麻醉，剪尾鳍放血5～10min，取头肾剪碎于淡水生理盐水中，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，加入08%的柠檬酸三钠溶液低渗40～45min。
（3）固定。
低渗结束后，离心5min（1 000r／min）。弃上清液，放入甲醇冰醋酸=91的固定液中固定7～10min，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，转入100%冰醋酸中处理1～2min，离心5min（1 000r/min）。弃上清液，再将肾组织块移入新配制预冷的卡诺固定液（甲醇冰醋酸=31）中，每隔15min更换一次固定液，重复3次，固定完毕放入青霉素小瓶中，加入新的固定液，用封口膜封口放入冰箱冷冻过夜。
（4）制片。
将固定过的样品取少量组织块于5ml小烧杯中，加入2～3滴50%冰醋酸，将组织制成细胞悬液后，加少量新配制的固定液，过滤后进行冷滴片法滴片过火，看到玻片上燃烧蓝色火焰即可。室温自然干燥。
（5）染色和镜检。
完全干燥的染色体玻片用体积分数为10%的Giemsa（pH＝68）染色液染色1～2h，蒸馏水冲洗，自然干燥。利用显微镜进行观察拍照（附图1-3）。
1512鱼类鳃细胞染色体标本制备
（1）PHA和秋水仙素处理。
用2～4mg/kg苯甲醇麻醉鱼，称重。每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液,剂量为6μg/g（鱼体重），18～20h后第二次注射同样剂量PHA，作用4～6h后，活体腹腔注射01%秋水仙素溶液，剂量为6μg/g（鱼体重），效应时间2～3h。
（2）取材。
用2～4mg/kg苯甲醇麻醉鱼，剪尾鳍放血5～10min。取鳃放入装有淡水生理盐水中的小烧杯中，不剪碎。
（3）低渗。
加入2ml 8‰的柠檬酸溶液室温下低渗40～45min。
（4）固定。
低渗后放入甲醇冰醋酸=91的固定液中固定7～10min，再转入100%冰醋酸中处理1～2min，再在常规甲醇冰醋酸=31的固定液中固定2～3次，每次15min，完毕后放入冰箱冷冻过夜。
（5）滴片。
将固定过的样品吸去固定液，加入1～2滴50%冰醋酸，用镊子将鳃丝轻轻抖动，用手术剪将鳃剪碎，制成细胞悬液后，加少量新配制的固定液，用筛绢网过滤。取预冷湿玻片一张用吸管吸取过滤后的细胞悬液，从30cm左右的高度滴到载玻片上，用口吹散滴液，置于酒精灯上过火，看到玻片上燃烧蓝色火焰即可，最后摆放到解剖盘中室温下自然风干。
（6）染色。
完全干燥的染色体玻片用pH值为74的磷酸缓冲液配制的体积分数为10%的Giemsa染色液染色1～2h，自来水冲洗，自然风干。
（7）镜检，拍照。
先在低倍镜下观察，选择染色体形态良好、分散适中的中期分裂相，然后换油镜拍照。四倍体泥鳅鳃细胞染色体相参见附图1-4。
1513胚胎细胞染色体标本制备
取发育至肌肉效应期的红鳍东方鲀的受精卵各40个，分别放入铺有琼脂糖的培养皿中，加入适量生理盐水，在解剖镜下用钟表镊子剥去卵膜、卵黄，00025%秋水仙素浸泡45min，08%柠檬酸低渗15～20min，用预冷的卡诺固定液（甲醇冰醋酸=31）重复固定3次，每次15min，冷冻（-20℃）过夜。次日吸出一个胚胎到4孔载玻片上，滴1～2滴50%冰醋酸，用黄枪头捣碎呈细胞悬液，再加入一滴预冷的卡诺固定液，用枪头混匀，吸出所有液体，进行冷滴片，过火，风干，10%吉姆萨染色30min后冲洗，风干，镜检，拍照（附图1-5）。
152核仁银染法（Ag-NORs）
细胞的核仁数目与倍性有关，在正常情况下，单倍体细胞含一个核仁，二、三、四倍体细胞分别含二、三、四个核仁。在多倍体鱼类的倍性鉴定中，银染核仁组织区法与其他多倍体鱼类的倍性检测方法相比，不但快捷准确而且省时省力，无须特殊的仪器,在条件相当简陋的实验室就可以进行操作，是值得推广的一种好方法。
具体操作方法主要参照Howell and Black（1980）的快速银染法并略加修改。50%AgNO3与明胶溶液21在染色体片子上混合，加盖玻片，70℃恒温箱中处理2～3min，用70℃去离子水冲洗，自然干燥；干燥后显微镜下观察，拍照（图1-4）。
图1-4德国镜鲤间期细胞核Ag-NORs 标尺示10μm
153细胞核体积测量法
同一研究对象的二倍体和多倍体个体，其细胞核及细胞大小不同。二倍体与三倍体、四倍体血红细胞核体积预期比值为1152。
红细胞测量的具体操作简单。以泥鳅为例（附图1-6）。
（1）血涂片的制备。麻醉鱼采用一次性注射器从实验鱼尾部静脉处采血，涂片后用甲醇固定3～5min，吉姆萨染液染色5min。
（2）镜检拍照。先用低倍镜下观察，找到细胞分散均匀、不重叠、不变形的视野，换高倍镜观察后用数码显微拍照。并在同样倍数下拍台微尺。
（3）用Adobe Photoshop软件测量。计算核体积=4/3πab2或=ab2/191，式中a—为长半轴，b—为短半轴。
154极体计数法
极体计数法已作为一种简单快速的方法用于早期胚胎三倍体的检测（Beaumont等，1986）。观察鱼类极体释放的具体方法是将受精卵用波恩固定液固定后，用刀片将卵黄切除，依常规方法脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，染色（一种是用DAPI染色，另一种是苏木精，曙红双重染色）以后步骤与正常的组织切片相同（附图1-7）。
155DNA含量测定方法
细胞核内的DNA含量与它们所含的染色体数成比例，当细胞内染色体倍数增加时，其DNA含量也相应增加，所以可以通过DNA含量来确定染色体数目的多少。
1551流式细胞仪
用流式细胞仪测定细胞DNA含量具体方法（以泥鳅为例）。
（1）机械法。剪取约5mm×5mm大小的尾鳍,放置于干净的小培养皿中,用刀片将尾鳍剁碎；将剁碎的样品转入样品管中,加入DAPI染液,用SK-1快速混匀仪振荡10～15s,使细胞脱落游离；用300～500目小筛网过滤混悬液到测试小管中,制得细胞悬液,使样品管液体体积最终在15～2ml,样品细胞的最终浓度为105～106个/ml。
（2）抽取血液法。用经肝素润湿的一次性注射器在尾静脉抽血002～003ml，注入加有1ml淡水生理盐水的离心管中，轻轻摇动使血液混匀；用滴管抽取血液混合液一滴到测试小管中，加入10～15mlDAPI染液,上机进行测试。检测结果以DNA直方图的形式表示，图中横坐标代表DNA的相对含量，纵坐标代表细胞频率。从图中可看出三倍体泥鳅的DNA含量是二倍体泥鳅DNA含量的15倍；四倍体泥鳅的DNA含量是二倍体泥鳅DNA含量的2倍（图1-5）。
A:二倍体；B：三倍体；C：四倍体
图1-5泥鳅流式细胞仪倍性检测结果
1552显微荧光测定法
将被测材料用固定液固定后，将组织用细胞匀浆仪弄碎，使细胞游离制成涂片标本，或者采取血液制成血涂片固定。标本用DAPI染色，然后在显微分光光度计，通过365nm长的紫外线，用扫描测光装置测定细胞核的荧光强度，获得处理组个体和对照组个体之间细胞核DNA相对含量曲线，从而测出二者的DNA比率，即可确定处理组个体的倍性，进而计算出三倍体的诱发率。
16多倍体的生物学特性
161性腺发育
人工诱导的三倍体鱼类预期是不育的，因为奇数染色体组将导致减数分裂姊妹染色体配对的不平衡而不能进行，由此引发性腺发育的受阻或非整倍体配子的产生，已有许多研究证明了这一点。如诱发尼罗罗非鱼三倍体雌雄皆为不育；三倍体草鱼和三角鲂杂种的雌性完全不育，雄性个体的生殖细胞只能发育到精原细胞阶段，也为不育；三倍体的鲤鱼性腺不能发育；黑鲷三倍体性腺明显小于二倍体，即使2～4龄的性腺能产生精子但其形态异常且浓度较低。一般三倍体雄鱼比三倍体雌鱼呈现较好的性腺发育。
四倍体个体的性腺发育正常，但育性较二倍体表现差。李建中等（2002）采用组织切片技术对异源四倍体鲫鲤的性腺进行研究，结果表明，异源四倍体鲫鲤的性腺发育是正常的，雌雄个体都能达到性成熟。两性可育并遗传稳定的四倍体鱼为探讨自然界鱼类多倍体形成机制提供了重要的理论依据，为鱼类多倍体育种提供了新的途径。
162生活力与生长
大多数学者的研究发现，人工诱导的三倍体鱼类具有正常的生活力。如三棘刺鱼、鲽与川鲽杂种、奥利亚罗非鱼、鲤、草鱼以及斑马鱼等的生活力与同种的二倍体没有明显的区别。但也有例外，如虹鳟和银大麻哈鱼等人工诱导三倍体的生活力比二倍体差一些。
在早期生长上，有的三倍体鱼要比二倍体快。吴清江等（1979）用红鲤×镜鲤得到的三倍体孵出的8个月内体重比二倍体重26～263倍。三倍体奥利亚罗非鱼14周时，其个体比二倍体鱼个体大。但更多的研究表明三倍体和二倍体两者在早期生长方面无明显差异。还有例子表明三倍体鱼的生长低于二倍体。
163其他性状
经过对鱼肉质量、含氧量、抗病性和感觉特性等性状的研究发现三倍体虹鳟的鱼肉质量优于二倍体；三倍体大西洋鲑需氧能力低于二倍体，故可适于低氧环境养殖；三倍体香鱼的抗病力与二倍体无明显差异。
多数情况下三倍体的个体不比二倍体大，这必然伴随三倍体个体细胞数量的减少，同时也伴随各个器官细胞数量的减少。脑细胞数量的减少导致三倍体的智力可能比二倍体低下，这有可能使三倍体的竞争力较低。同样分泌器官细胞数量的减少也可能使调节免疫力等的物质的分泌量减少，如激素等。
17多倍体的应用
171提高生长速度
由于三倍体不需要消耗能量用于生殖腺发育，可将所有的能量用于生长，故三倍体的生长速度在性成熟期间及以后会具有生长优势。从水产养殖角度出发，人工诱导三倍体的兴趣多半是寄希望于三倍体会比二倍体生长得更快，其生长情况因种类和发育阶段而异。研究发现，在性成熟时，三倍体普遍比二倍体生长快。三倍体鱼早期生长与二倍体相比没有什么优势，但到了产卵期，其生长速度明显快。生物的生长往往在性成熟以后会停滞或大幅度的减慢，有人期望三倍体因性腺不发育，因此也就不会停止身体的生长，这样养殖生产即可以获得较大个体的养殖对象，例如，期望大麻哈等鱼类的三倍体可以生长到金枪鱼那样大小。
172控制过度繁殖
三倍体鱼类的性腺不发育，所以不会产生后代，这为三倍体的生物学利用提供了广泛的空间。可以用养殖不育的群体控制养殖密度，例如罗非鱼的繁殖能力较强，且一年数次产卵，导致养殖水体中数代同塘，个体大小非常不匀，放养三倍体则不会产生此类问题。用三倍体群体完成一些短期的目标，目标完成以后群体也自然消亡，如在杂草丛生的水体放养不育的草鱼三倍体既能除草又可防止因其繁育后代导致的生态变化。此项技术在鲍鱼、珍珠贝上效果也特别明显。
173延长寿命
对于那些在性成熟时会遭受损失或有成熟死亡的鱼类来说，不育三倍体可能比二倍体存活得更长久。在鲑鳟鱼类中如虹鳟在缺乏产卵支流的湖泊中会有很高的死亡率，又如大麻哈鱼等降海的鲑科鱼类一生产卵一次，产卵后通常死亡（成熟死亡），而三倍体大麻哈鱼就不存在这种情况，它的性腺不发育，因此就不会性成熟，也就不会因性成熟而发生成熟死亡。香鱼和公鱼的寿命很短，一般是在秋季产卵繁殖，而后结束其一生，而三倍体香鱼可以跨年生长，还可以全年上市销售。
174改善品质
三倍体物种的细胞体积大，因此同样大小的二倍体和三倍体，三倍体的细胞数量要少于二倍体，相对的筋膜等也少于二倍体，并且三倍体的鱼肉看起来较有光泽，因此三倍体个体的肌肉的口感柔软，更受消费者的偏爱。Wolters等（1982）认为，三倍体斑点叉尾具有比二倍体小的头部，这样净肉率高于二倍体，在加工过程中浪费较少。三倍体香鱼的鱼片厚度平均比二倍体高；三倍体和二倍体鲽与川鲽杂种也有同样情况。
性成熟的动物往往伴随着肌肉质量的下降，动物生产中采取阉割的办法避免肌肉质量下降。对于那些无法采用阉割技术的动物，则在性成熟前上市保证肌肉的品质。所以欧美国家消费虹鳟等鱼类时，偏好个体较小的未成熟个体。三倍体的鱼类因性腺不发育，生长中没有肌肉质量下降的问题。
18多倍体泥鳅研究现状
泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是广泛分布在中国大陆、朝鲜半岛、日本列岛、台湾等地的鲤形目、鳅科、泥鳅属的小型淡水鱼类（斉藤憲治，1989）。泥鳅肉质鲜美，营养丰富，富含蛋白质及多种维生素，并具有药用价值，被誉为“水中人参”（刘孝华，2008）。泥鳅具有广阔的市场前景（谷士荣，2011），在我国南北各地，泥鳅作为滋补佳品早已摆上家庭、酒店的餐桌，日本和韩国人视其为高档营养食品，更是畅销不已。据国内外泥鳅市场调查显示，从2001年至今，连续走俏市场。价格连年攀升。但由于多年的过度捕捞，自然水域生态环境日益恶化，我国野生泥鳅的产量正逐渐降低，泥鳅已经成为我国目前主要的养殖品种。随着养殖规模的逐渐扩大，高产、高效的优良品种已成为泥鳅养殖业发展的瓶颈之一。三倍体鱼类以其育性差、生长快等特性而成为鱼类遗传育种研究的热点。因此，规模化培育三倍体泥鳅，对促进泥鳅养殖生产的发展，将具有重要的经济价值和广阔的应用前景。
泥鳅的倍性一直受国内外学者所关注。国外主要集中在日本，1979年，日本学者Ojima和Takai（1979）首次在野生群体的泥鳅样本中发现染色体数为2n=50的二倍体、3n=75的三倍体和来自水产品市场的（来源不明）4n=100的四倍体个体。Arai研究室历经20多年对日本产自然三倍体及起源不明的四倍体（来源市场）进行了系统的研究。发现日本除正常有性生殖的二倍体泥鳅外，还存在无性生殖二倍体和杂种生殖的三倍体，但没有发现自然四倍体（Morishima K et al.，2002；Arai K et al.，1991；Zhang Q et al.，1999；荒井克俊，2004）。日本产三倍体是由于同一栖息场所的二倍体泥鳅产生二倍体未减数卵与精子偶尔受精形成的，这些未减数的二倍体卵，精子不参与通过雌核发育进行繁殖。因此，把这种二倍体称为无性生殖二倍体，经细胞学研究表明，无性生殖二倍体的未减数卵的细胞学机制是减数分裂前核内有丝分裂（荒井克俊，2004）。并通过线粒体DNA序列及微卫星分析进一步证明了日本泥鳅分为两个不同的种类，无性生殖二倍体是由两个不同种间泥鳅杂交形成的（Kagayaki Morishima et al.，2008）。通常人工诱导的三倍体无论雌雄都不育，而日本产自然三倍体雄的不育，雌的可以产生单倍体（1n）和三倍体（3n）卵。并证实了起源不明的四倍体是遗传的四倍体（2n=100），同时利用起源不明的四倍体通过人工繁殖实验及染色体操作培育出三倍体、四倍体、五倍体及六倍体，并对其后代的染色体数目、成活率等生殖特性进行了详细的研究（荒井克俊，2009）。
我国关于自然多倍体泥鳅的研究以往报道较少。主要集中在四倍体核型（李康等，1983；李渝成等，1987；印杰等，2005）、倍性鉴定（李雅娟等，2008；高泽霞等，2007；郭伟荣等，2009）、细胞色素b基因序列（Yang C et al.，2009）、群体遗传结构（周玲玲等，2011）、线粒体基因多态性（郑鹏飞等，2011）等研究上。本书著者从2004—2011年与日本北海道大学荒井克俊教授进行了合作研究。为探讨中国天然多倍体泥鳅的分布、起源及形成机制，对中国泥鳅线粒体DNA序列分析、自然多倍体的分布、体细胞染色体核型分析、染色体带型和FISH研究、减数分裂染色体行为、人工诱导雌核发育及生殖特性等方面进行了系统的研究。初次证实了我国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体(4n=100)、是同源四倍体、能产生正常的2n配子（雌或雄）。2012—2016年李雅娟主持的国家自然科学基金项目“泥鳅杂交三倍体染色体组稳定性及其表观遗传机制解析（31272650）”首次利用天然四倍体泥鳅与二倍体杂交制备了1种新型的杂交三倍体，并对早期的染色体数目、DNA含量、生殖特性、减数分裂行为、性腺发育及表观遗传机制等进行了研究。从表观遗传学的角度对杂交三倍体泥鳅及其亲本DNA甲基化水平差异和关键基因的甲基化调控机制进行分析，探索杂交三倍体优势性状的表观遗传机理。从而促进杂交三倍体泥鳅杂种优势的形成。为今后鱼类三倍体杂种优势形成机理提供理论与技术支持。为我国三倍体鱼类的产业化探索高效易行的新途径奠定基础。
第2章中国自然多倍体泥鳅的分布、染色体核型及形态特征
| ISBN | 9787511630834 |
|---|---|
| 出版社 | 中国农业科学技术出版社 |
| 作者 | 李雅娟 |
| 尺寸 | 16 |