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《钙蛋白酶系统》由中国农业科学技术出版社出版。
作者简介
作者为山西农业大学食品科技学院博士，教师。长期从事动物营养合成、微量元素分析以及畜禽肌肉神经系统对动物循环、内分泌等的生理生化反应等研究。
目录
1钙蛋白酶系统的研究史及分类
1.1钙蛋白酶的研究史及定义
1.2钙蛋白酶的命名
1.3钙蛋白酶的生物进化和分类
1.3.1脊椎动物的钙蛋白酶
1.3.2经典CAPNs进化的路线图
1.3.3理解经典CAPNs在脊椎动物发展史中的价值
1.3.4进化过程中赋予经典CAPNs的选择性特征
1.3.5跨越脊椎动物类群，经典calpainmRNA具有不同的表达
1.3.6人类中经典calpains的表达
1.4人类的钙蛋白酶
1.5其他物种中的钙蛋白酶
1.6线粒体中的钙蛋白酶
1.6.1线粒体中的钙蛋白酶
1.6.2线粒体钙蛋白酶的调控
1.6.3线粒体钙蛋白酶的功能
1.6.4线粒体钙蛋白酶在神经元细胞死亡
2钙蛋白酶系统具有显著特征的成员——CAPN1（μCL）、CAPN2（mCL）和CAST
2.1CAPN1（μCL）、CAPN2（mCL）的特性
2.1.1CAPN1（μCL）、CAPN2（mCL）的cDNA序列
2.1.2CAPN1和CAPN2的基因组序列
2.1.3CAPNs的3D结构研究
2.1.4CAPNs功能表达研究
2.1.5自溶和酶原问题
2.2CAST（calpastatin）的特性
2.2.1CAST的DNA序列
2.2.2CAST的结构域结构
2.2.3与CAPNs的结合
2.2.4CAST的遗传学研究
2.3CAPNs和CAST的纯化及活性检测
2.3.1CAPNs及CAST的分离提纯
2.3.2Caipains的活性测定
3钙蛋白酶系统的其他成员
3.1非经典CAPNs成员中的亚家族
3.1.1严格的PalB同系物（PalB亚家族中的PalB群）
3.1.2PalB亚家族的TRA—3群
3.1.3PalB亚家族的CAPN10群
3.1.4SOL亚家族
3.1.5植物calpain
3.1.6其他calpain成员
3.2普遍存在的组织特异性CAPNs
3.2.1组织特异性CAPNs的表达
3.2.2CAPN3（p94）
3.2.3CAPN8（nCL—2）和CAPN9（nCL—4）
4钙蛋白酶系统的活性调节
4.1钙离子对CAPNs的调节作用
4.1.1钙离子协助CAPNs对底物的精准定位
4.1.2钙离子直接结合于CAPNs的核心结构
4.1.3钙离子与CAPNs的其他结合位点
4.2CAPNs的自溶
4.2.1CAPN1和CAPN2的自溶是分子内反应
4.2.2体外人工纯化后的CAPN1和CAPN2的自溶反应
4.3小亚基解离对CAPNs的调节作用
4.3.1生理条件下，小亚基解离与否
4.3.2小亚基在CAPNs聚集中的作用
4.4CAPNs核心酶的作用
4.4.1抑制剂与CAPNs核心酶的结合
4.4.2使用CAPNs核心酶可以筛选理想的底物序列
4.4.3非核心结构域对CAPNs活性的辅助功能
4.4.4为何CAPN2核心酶的活性较差？
4.4.5其他CAPNs核心酶
4.5CAPNs磷脂化作用
4.6CAPNs活性的负调节——CAST
4.7钙蛋白酶是与膜结合、发生自溶而发挥蛋白酶活性的吗？
4.8钙蛋白酶是受Ca2+和钙蛋白酶抑制蛋白调节的吗？
4.9钙蛋白酶激活因子（CAPNsactivator）
4.9.1钙蛋白酶激活因子（UK114）的结构
4.9.2钙蛋白酶激活因子对钙蛋白酶的激活特性
4.9.3钙激活蛋白酶激活蛋白（UK114）研究进展
5钙蛋白酶系统与相关疾病
5.1CAPN3与相关疾病
5.1.1CAPN3与LGMD2A
5.1.2与CAPN3相作用的分子
5.1.3CAPN3的抑制和激活
5.1.4CAPN3可能参与细胞周期调控
5.1.5CAPN3对疾病的防御作用
5.2CAPNs系统与肿瘤
5.2.1CAPNs在癌症中的上调节或下调节
5.2.2CAPNs与细胞发育
5.2.3CAPNs和细胞迁移—侵袭
5.2.4非典型的和组织特异性的CAPNs与肿瘤的关系
5.3CAPNs系统与糖尿病
5.3.1CAPN10的结构、功能
5.3.2CAPN10与Ⅱ型糖尿病的作用
5.4CAPNs系统与眼部疾病
5.4.1LEC凋亡是白内障形成的细胞学基础
5.4.2CAPNs的激活在白内障发生机制中的作用
5.5胃肠特异性CAPNs
5.6CAPNs系统与阿尔茨海默症
5.6.1阿尔茨海默病的发病机理
5.6.2CAPNs在阿尔茨海默病症中的作用
5.7CAPNs系统与脑部疾病
5.7.1CAPNs与脑缺血疾病
5.7.2CAPNs与脑外伤、脊髓损伤、脱髓鞘性疾病等的神经元退变
6钙蛋白酶系统与肉的品质及肉的嫩化
6.1牛肉的品质性状
6.2影响畜禽肉品质的因素
6.2.1肉本身的因素
6.2.2屠宰前的影响因素
6.2.3宰后的影响因素
6.3有关牛肉用性状的基因
6.3.1有关牛的肉用品质基因标记的概述
6.3.2一些牛肉品质候选基因的概述
6.4钙蛋白酶系统与肉品质的关系
6.4.1CAPNs对肌肉／细胞骨架蛋白质的影响
6.4.2起始肌原纤维蛋白的转换
6.4.3促进肌肉微观组织结构的改变
6.4.4促进宰后动物肌体的蛋白质水解
6.4.5对肌肉嫩化的作用
6.5钙蛋白酶系统是动物宰后促进肌肉嫩化的重要酶系统
6.5.1宰后肉嫩化的机制：酶假说与钙理论
6.5.2内源蛋白酶在肉嫩化中的作用
6.6肉嫩化的方法及机理
6.6.1物理嫩化法
6.6.2化学嫩化法
6.6.3生物嫩化法
参考文献
序言
前言
PREFACE
钙蛋白酶系统CAPNs（Calpain system）是高度可调的、依赖于Ca2+的蛋白质水解酶系统。钙蛋白酶（calpain）的研究始于1964年，钙蛋白酶抑制蛋白CAST（calpastatin）的研究始于1976年，而钙蛋白酶激活蛋白（calpain activator）的研究始于1982年。钙蛋白酶系统的研究是畜牧学领域、医学领域和肉类科学领域的热门研究课题。
Calpain是一种钙激活中性半胱氨酸内肽酶(EC 342217)，分布于所有脊椎动物细胞中，在果蝇属和昆虫中发现了此酶，最新的研究发现植物细胞也含有此酶。虽然不同生物细胞中的钙激活蛋白酶的结构略有不同，但是，钙激活蛋白酶的结构都是由大小两个结构域组成。
钙蛋白酶系统的体外研究表明，CAPNs仅裂解蛋白质有限的专一位点，产生大的多肽片段，而不是分解成小肽或氨基酸。这些蛋白酶是高度可调、且依赖于Ca2+的蛋白水解酶系统复合体。该系统在许多细胞骨架蛋白的结合与分解中起—定作用，尤其对依附于质膜或亚细胞结构的细胞骨架纤维部位。CAPNs降解作用较彻底，导致横纹肌的肌原纤维Z盘裂解，从而使肌节部位断裂。因此，CAPNs在动物机体屠宰后，肌肉蛋白的水解引起肉的嫩化中起相当重要的作用。它还参与居间纤维的分解、神经丝蛋白的水解、表皮作用因子受体的降解、成肌细胞融合、磷酸化酶b激酶和蛋白激酶c的活性、类固醇激素结合蛋白的转化、血小板的凝集等。CAPNs不仅参与上述正常的细胞内级联信号转导，也与机体内发生的各种病理状态，肿瘤、局部缺血、老年性痴呆症、白内障、肌肉萎缩、脓毒、切东二氏综合征、炎症、关节炎、疟疾等各种疾病相关联。
迄今，钙蛋白酶系统已成为最广泛和深入研究的蛋白酶系统之一，美国、日本、法国、以色列、英国、加拿大和意大利等国家的科学家都对它产生了浓厚的兴趣。我国关于钙蛋白酶系统的研究始于20世纪90年代，本书作者曾于2006年出版过《钙激活蛋白酶与基础研究》一专著，本书更完整、系统地对钙蛋白酶系统的研究史、生物进化、系统命名、活性调节与结构的关系及与疾病的关系进行了叙述和总结。在书的撰写过程中作者还将近年来的科研成果进行了融合和整理，是一本该领域研究的系统性较强的学术专著。
本书由常泓和尹淑琴共同编著，其中第1章钙蛋白酶系统的研究史及分类、第二章钙蛋白酶系统具有显著特征的成员——CAPNI（μCL）、CAPN2（mCL）和CAST及第三章钙蛋白酶系统的其他成员由常泓编著；第四章钙蛋白酶系统的活性调节、第五章钙蛋白酶系统与相关疾病及第六章钙蛋白酶系统与肉的品质及肉的嫩化由尹淑琴编著。在编著过程中，研究生张晓红、周全和冯晓赟等同学协助提供资料并进行编辑审核，在此一并表示感谢。由于我们水平有限，加之钙蛋白酶涉及各学科领域广泛，学科发展迅速，书中的疏漏及不妥之处在所难免，殷切期待各位读者和同行的惠正。
本书适合于生物学、畜牧学、兽医学、食品科学、医学领域的研究生、科研人员和肉类科学工作者以及其他科学爱好者阅读参考。
编著者
2016年10月
文摘
〖1〗钙蛋白酶系统
〖1〗1钙蛋白酶系统的研究史及分类
1钙蛋白酶系统的研究史及分类
1964年,Gordon Guroff发现钙蛋白酶是一种细胞内的Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶（EC342217；Clan CA，C02家族）（Frickel，et al，2004；Silvennoinen，et al，2004）。在1990年之前，钙蛋白酶被称为CANP（calciumactivated neutral protease，Ca2+ 激活中性蛋白酶）、CASF（Ca2+ activated sarcoplasmic factor）、CDP（Ca2+ dependent protein），KAF（kinase activating factor）等。1990年后钙蛋白酶统称为calpain，缩写为CAPNs。钙蛋白酶存在于几乎所有真核生物及一少部分细菌中，但在古细菌中不存在。最近的研究发现植物中也存在钙蛋白酶。钙蛋白酶具有一定的蛋白酶水解活性，对底物的结构和活性具有转化或调节功能，所以被认为是一种调节蛋白酶。在人类基因组中，有15个基因，如CAPN1，CAPN2等，编码一个类似于钙蛋白酶的蛋白酶结构域。它们的产物都是钙蛋白酶的同源物，这种同源物具有不断变化的结构并且由不同的功能结构域组成。
11钙蛋白酶的研究史及定义
1964年，Gordon Guroff（1933—1999）从鼠脑中部分纯化得到一种依赖于Ca2+的中性蛋白酶，随后被证明是calpain（Guroff，1964）。同年，Meyer,Fischer和Krebs报道了被Ca2+激活的小鼠骨骼肌磷酸化酶b激酶和部分纯化的反应蛋白产物，他们称该酶为KAF（kinase activating factor）（Meyer，et al，1964）。4年后，Huston Krebs（Huston，Krebs，1968）和Drummond Duncan（Ono，et al，2016）分别报道了这种蛋白酶是依赖于Ca2+的蛋白酶，并证实了这种酶对磷酸化酶b激酶的蛋白水解激活作用不是生理必需的。Krebs和Fishers的研究兴趣便转向磷酸化及级联反应，于1992年获得诺贝尔奖（Fischer，Krebs，1955a；Krebs，Fischer，1955b），从此，Kerbs就改变了对蛋白水解激活的生理重要性的想法。1972年，Darrel EGoll和他的同事，鉴定了一种因子，它依赖于Ca2+打断骨骼肌Z线，并命名它为CASF（Ca2+ activated sarcoplasmic factor），这个因子随后也被证明是calpain（Busch，et al，1972），这一研究开始了calpain在肉的宰后嫩化中的作用的研究。1977年，Yasutomi Nishizuka和他的同事鉴定calpain为蛋白激酶c（PKC）的激活因子（Takai，et al，1977），并开辟了一系列calpain与PKC的相互联系研究（Takai，et al，1982a；Kishimoto，et al，1983b；Ogawa，et al，1981c；Kishimoto，et al，1981d）。1978年，Kazutomo Imahori（1920—)和他的同事首次纯化得到了单一组分的鸡钙蛋白酶，命名为CANP（Ishiura，et al，1978）。这一研究开启了钙蛋白酶系列的、重点的研究，并使钙蛋白酶成为细胞内重要的激活酶类（Suzuki，Ishiura，1983a；Suzuki，1983b；Suzuki，et al，1981）。随着这一里程碑式的研究工作的开辟，Imahori团队建立了calpain研究课题组，并发表了许多重要的研究报告，主要是关于底物特异性（Ishiura，et al，1979），人肌肉（Suzuki，et al，1979）中纯化calpain，抑制剂（Sugita，et al，1980a,b），自溶（Suzuki，et al，1981,）和激活（Suzuki，Tsuji，1982a；Suzuki，1982b）等。同年，Takashi Murachi(1926—1990)和他的同事报道了一种内源性钙蛋白酶特异性抑制蛋白（Nishiura，et al，1978），并在1981年提出以calpain代替CANP和以calpastatin为蛋白酶抑制剂的名称（Murachi，et al，1980）。1984年，Koichi Suzuki（19392010)和他的同事揭示了钙蛋白酶催化亚基（Ohno，et al，1984）的完整的一级结构，并且对钙蛋白酶的研究转向其结构与功能关系的研究。此后，CANP和calpain一直同时被使用。直到1990年，Suzuki和Imahori才解决了这一复杂的问题。在第八届蛋白质水解和蛋白质转换（Suzuki，1991）的国际会议上提出了calpain为授权名称。在1991年（Croall，DeMartino，1991）和2003（Goll，et al，2003）年的两个经典文献及以后的综述（Zatz，Starling，2005；Murachi，1990b；Yamashima，2004c；Wendt，et al，2004d；Wells，et al，2005e；Turner，et al，2005f；Tian，et al，2004g；Sorimachi，Kawabata，2003h；Ray，et al，2003i；Ridderstrle，et al，2005j；Ray，Banik，2003k；Nixon，2003；Mehendale，Limaye，2005m；Liu，et al，2004n；Laval，Bushby，2004o；Horikawa，2005p；Harwood，et al，2005q；Friedrich，et al，2004r；Franco，Huttenlocher，2005s；Costelli，et al，2005t；Carragher，2006u；Branca，2004v；Biswas，et al，2005w,2004x；Bartoli，Richard，2005y；Baud，et al，2003z；Kuchay，Chishti，2007；Liu，et al，2008；Bertipaglia，Carafoli，2007；Croall，Ersfeld，2007；Suzuki，et al，2004；Sorimachi，et al，1997）对calpains的研究做了详尽的阐述。
Calpain的纯化工作，1976年（Reville，et al，1976）为90%纯度，1978（Ishiura，et al，1978）年达到单一组分。研究最广泛的就是哺乳动物的μcalpain和mcalpain及鸡的μ/mcalpain，之后称它们为传统的calpains（Ohno，et al，1991）。鸡的μ/mcalpain（Suzuki，1991）是介于μcalpain和mcalpain之间的一种calpain（Ishiura，et al，1978,1979；Sorimachi，et al，1995），它的催化亚基与哺乳动物的CAPN11同源（Macqueen，et al，2010）。calpain的结构研究表明，calpain由大亚基（80kDa）和小亚基（30kDa）组成，这是另一个重要的calpain特性。
从1984年Suzuki的文章（Ohno，et al，1984）发表以后，cDNA基因克隆的研究迅速增长，鉴定了许多钙蛋白酶及相关分子，这些分子中包括15个人类calpain基因，现在称为CAPNn（n=1,2,3，和5～16）。有2个基因为calpain调节小亚基，CAPNS1和CAPNS2，CAST代表calpastatin。鸡μ/mcalpain的催化亚基的cDNA于1984（Ohno，et al，1984）年被克隆。其后，许多种类的calpain的cDNAs被克隆并测序。
在获得的氨基酸序列中，有一组肽酶含有蛋白酶结构域，这个蛋白酶结构域在这一组肽酶结构域中相互相似但却明显地区别于其他肽酶（Berti，Storer，1995）。在保守性结构域的NCBI（MarchlerBauer，et al，2009）数据库中搜索“CysPc”得到不同的生物有机体包括：植物、真菌、酵母菌，甚至细菌中几乎所有的calpain同源物的序列。因此，根据其氨基酸序列与哺乳动物μcalpain和mcalpain的相关性，calpain被定义为与人类μcalpain大亚基蛋白酶结构域具有氨基酸序列极度相似性的蛋白质。Calpain属于木瓜蛋白酶超级家族中的半胱氨酸蛋白酶，其结构分类和家族成员如图1-1和图1-2所示。
图1-1calpain超级家族的结构分类发展历史
图1-2CAPNs超家族成员的图表结构
注：Calpain同源物存在于几乎所有的真核生物及一少部分细菌中。在历史上，有一些系统命名法命名结构域。在本书中为避免混淆，这些结构域在相应的结构上写上其缩写，如：PC1（蛋白酶核心结构域1），PC2（蛋白酶核心结构域2），C2L（类似C2结构域），PEF（pentaEFhand）等。标记有：N和N端、PEF(L)和PEF(F)分别表示大催化亚基和小调节亚基的PEF结构域；GR表示富含Gly疏水结构域；AS表示选择性剪接产物；NS/IS1/IS2为CAPN3独特的序列。C2表示C2结构域；MIT表示微管相互作用和运输模型；Zn表示锌指结构；SOH表示SOL同源物结构域；DIS表示CALPA具体的插入序列；TM表示横跨膜的结构域；CSTN表示类似calpastatin结构域；IQ表示与钙调蛋白互动的模型
12钙蛋白酶的命名
早期钙蛋白酶的命名是由发现者根据来源、结构特点、分子大小等情况而确定的，随着钙蛋白酶研究的深入和一些会议的召开，该领域的专家一致同意采用基因—产物命名法，如下表所示，如哺乳动物CAPN1基因的产物为CAPN1（μcalpain催化大亚基，缩写为μCL）；CAPN2基因的产物为CAPN2（mcalpain催化大亚基，缩写为mCL）。方括号里的为旧名称，如CAPN1［μCL］和CAPN2［mCL］、CAPN3 ［P94 ］、CAPN5（hTRA3）、CAPN7（PalBH）、CAPN8［nCL2 ］、CAPN9（nCL4）、CAPN15（SOHL）和CAPN16（C6或f103）等。
13钙蛋白酶的生物进化和分类
根据CAPNs在组织中的表达情况，可以将其分为“普遍存在的”和“组织特异性”2种（Sorimachi，et al，2011；Ono，Sorimachi，2012），这种分类系统在过去10年的许多综述文章中都可以看到，在最近关于哺乳动物的文章中也可以查到。但是，最近一篇文献的报道与这一分类法不相符合，即“组织特异性”的CAPN3也表达于许多其他组织中，而不仅仅表达于肌肉组织（Farkas，et al，2003）。这一研究工作引起了一定的重视，一些过去被广泛认为的组织特异性表达的钙蛋白酶也可能在其他位点表达。
CAPNs研究的另一个局限就是大多研究都集中于哺乳动物，从这个意义上讲，我们所观察到的基因表达模式和功能是广泛适用于所有的生物吗？CAPNs家族的进化史研究充分说明了这一问题。CAPN11过去称为鸟中的μ/mcalpain，它在胎盘哺乳动物中以一种高度限制的方式表达，但它最初的功能是在各种组织中广泛表达（Macqueen，et al，2010），表明CAPN11在CAPNs家族中占有非常关键的位置；特别是CAPN1和CAPN2的标志性的普遍存在的基因型遗传自CAPN11,因此CAPN11的功能与CAPN1和CAPN2功能同样重要。尽管如此，各类综述文章都毫无疑问地称之为“组织特异性”CAPNs（Macqueen，et al，2010；Johnston，et al，2011），而且CAPN11的重要性被广泛地认为是不重要的。从这个角度来说，其他CAPNs在脊椎动物进化中的不同的表达和功能达到一个什么程度，目前还不知道。
131脊椎动物的钙蛋白酶
Macqueen DJ等从最新研究的200多个用贝叶斯系统发育分析中确定了脊椎动物谱系中经典CAPNs的序列（Macqueen，Wilcox，2014）。结果与目前关于经典关系的假说基本一致（Macqueen，et al，2010a；Jékely，Friedrich，1999b），仅有两个主要分支与以前的不同（图1-3和图1-4）。
图1-4脊椎动物谱系图1-3中经典CAPNs家族成员的统计进化树
1311CAPN13：所有经典calpain之父
进化树的根部将公认的人类CAPN13和CAPN14的序列从所有其他序列中分离出来（不包含七鳃鳗或鲨鱼/银鲛），人类CAPN14是四足动物序列的一部分，从人类CAPN13和其他总鳍鱼类的姐妹群中分离出来，在这个群中，腔棘鱼处于最早的一个分支，这就说明CAPN13和CAPN14分离的复制事件发生在腔棘鱼进化的早期。
腔棘鱼中的CAPN13/CAPN14分群，然后从辐鳍鱼纲序列组中分离出来。这表明，单一的经典的CAPNs(在腔棘鱼中进化为CAPN13或CAPN14)存在于有颚类脊椎动物祖先中。使用CAPN13这个名字(尽管CAPN14也一样)，是明显地区分究竟是CAPN13还是CAPN14在腔棘鱼中是祖先。
辐鳍鱼中的CAPN13分支序列表明：这种基因来源于硬骨鱼祖先基因组拷贝，许多硬骨鱼谱系中也含有另外的CAPN13分支，在发育树中紧靠着，常常在同一染色体上成簇存在。猪和袋獾有两个拷贝的CAPN14，是最近出现的。非洲蟾蜍含有2个CAPN13基因，而且可变性大，可能起源于两栖动物祖先，因此，许多脊椎动物保持多拷贝的CAPN13/14。CAPN13/14包含在非经典CAPNs中，这就表明，CAPN13是古老的经典CAPNs家族的成员。七鳃鳗中缺失CAPN13，说明或者是基因丢失，或者是在基因组组装中缺乏，因为七鳃鳗起源比硬骨鱼起源更早，存在于进化更早的经典CAPNs族中。这些发现扩大了有限的单个哺乳动物中CAPN13和CAPN14的进化起源和分布的数据（Ono，Sorimachi，2012；Sorimachi，et al，2011；Dear，et al，2000），而且与过去的分析一致。
1312CAPN17:与CAPN12相关的一个新的CAPNs
在进化树上，还排列着3个大的分支，分离成3组序列。一个是鳍鱼；中间有七鳃鳗、两栖类、加上鳍鱼；最后一个是四足动物，包括人类CAPN12（图1-3）。这种分类法存在争议，表明存在分支错误，因此采用序列独立进化树分析（图1-5）。结果，进化树分成两个而不是3个分支，前面分开的鳍鱼和三足动物便隶属于一个群，与想象的种间关系一致。这个群包含人类CAPN12，表明CAPN12在有骨脊椎动物中保守。然而七鳃鳗、鲨鱼和银鲛却不在此群。同样也没有证据证明CAPN12在任何代表性的谱系中进行复制，这些数据证明了根据单一哺乳动物获得的CAPN12进化史。CAPN12的姐妹群，由准确的序列分类组成，七鳃鳗位于分支的最深处。这一分类说明存在一个新的经典的CAPNs家族成员,比所有脊椎动物都早，但在通常的陆生脊椎动物祖先中失去。我们命名此新的CAPNs为CAPN17，与现存的命名法一致。鲨鱼和银鲛中没有CAPN17，也没有任何证据证明在任何脊椎动物谱系中存在基因复制。
图1-5贝叶斯系统发育分析图1-4中经典CAPNs序列形成的虚拟错误分组
1313CAPN3和CAPN9存在于常见的脊椎动物祖先中
CAPN12/17内部序列可分为两个主要群。第一个群包含人类CAPN9，以所有主要脊椎动物谱系为代表(除了七鳃鳗)，这种分支模式遵循预期的物种关系。第二个群包含人类CAPN3，以所有主要脊椎动物为代表，这个群中最古老的两个分支都是七鳃鳗，这个模式与现存的单一的脊椎动物CAPNs家族成员不一致。一个原因就是通常的脊椎动物祖先有两个CAPN3基因，其中一个在有颚类进化过程中消失了，或者考虑其统计水平较低，如：更深的分支七鳃鳗序列就能代表了一个CAPN9基因。我们观察到，主要的硬骨鱼谱系中代表了两个CAPN3群，与基因组复制中保存一对复制相一致。总之，这些数据表明，CAPN3和CAPN9存在于通常的脊椎动物祖先中。
1314有颚类脊椎动物也含有主要经典钙蛋白酶
在CAPN3和9的内部分出一大支，包括人类CAPN1、CAPN2、CAPN8和CAPN11。这个群中得到最大认可的最深的分支就是七鳃鳗序列，这表明，在通常的脊椎动物祖先中拥有一个转变为CAPN1、CAPN2、CAPN8和CAPN11的原基因。
七鳃鳗的内部的一个分支是胎盘哺乳动物CAPN11序列群，由其他脊椎动物CAPN11序列群分离出来。这个CAPN11群的分离是一个过去观察到的分支错误，正确的CAPN11分群，得到广泛的进化树和共线性数据支持，存在于统计树中，由于CAPN11存在于鲨鱼/银鲛中，所以这些数据就支持CAPN11存在于有颚类脊椎动物祖先中。
分离CAPN11群，我们观察到一个群，包含人类CAPN1，物种覆盖其余的有颚类脊椎动物，分支模式与种群关系一致，表明CAPN1是有颚类脊椎动物的一个祖先。
分离CAPN1群，我们观察到两个群，分别包含CAPN2和CAPN8。CAPN2群主要以有颚类脊椎动物群为代表，有证据证明在明显的脊椎动物谱系中存在CAPN2的复制，如鲨鱼和银鲛序列分成两个姐妹群，以4亿年前分离的谱为代表。
鳍鱼可分成两个群，以斑点雀鳝和硬骨鱼类为代表，这表明，基因重复发生在此谱系分离前，约4亿年。另外，在鳍鱼CAPN2群内部，硬骨鱼又进一步分群。表明，在硬骨鱼祖先基因组复制中保留了另外的基因重复。
CAPN8群，以鳍鱼和叶鳍鱼为代表，但是没有鲨鱼和银鲛，然而由于CAPN2群含有鲨鱼/银鲛，所以就要求有颚类脊椎动物祖先有CAPN8。鳍鱼CAPN8序列分成两个群，与重复事件一致，存在于硬骨鱼祖先中。XXenopus保留CAPN8基因的3个拷贝。
132经典CAPNs进化的路线图
目前的研究结果表明，通常的脊椎动物祖先至少拥有6个经典的CAPNs，CAPN13、CAPN12、CAPN17、CAPN3和CAPN9和 CAPN11/1/2/8的原基因。过去的研究表明，在脊椎动物中，CAPN1和CAPN2产生于基因组倍增。目前认为，这种基因组倍增也发生于有颚类脊椎动物和七鳃鳗祖先中。因此，目前的数据表明：CAPN11、CAPN1、CAPN2和CAPN8产生于基因组倍增中。七鳃鳗的进化位置位于CAPN11、CAPN1、CAPN2和CAPN8之前是错误的。
133理解经典CAPNs在脊椎动物发展史中的价值
除哺乳动物外，脊椎动物CAPNs的鉴定是一项非常艰巨的任务。例如，假如开始这项调查工作采用Ensembl数据库，研究将面临的一个问题就是：大量的基因没有鉴定或者频繁地被错误注释。我们的工作使Ensembl数据库中命名已经确定的经典CAPNs序列被划分到受到广泛认可的系统发育群中。假如研究物种在我们的研究中没有代表，那么就BLAST，根据最近的相关物种来确定其相关的进化种群。
134进化过程中赋予经典CAPNs的选择性特征
经典calpains根据有颚类脊椎动物进化中纯化选择的优势划分为几个等级。CAPN3经历了最强的纯化选择，然后依次为CAPN1、CAPN12、CAPN9、CAPN2、CAPN8、CAPN11、CAPN17和CAPN13。排除哺乳动物，对于大多数有颚类脊椎动物，CAPN11在进化中受到最强的相对纯化选择，其功能非常重要。与此形成鲜明对比的是，在有胎盘类哺乳动物中，CAPN11和CAPN13是最不保守的经典的calpains，而CAPN13与CAPN11相比，在脊椎动物进化树中，一直经历着功能的变化。
CAPN2在高级保守的脊椎动物经典calpains中没有被划分出来，在不同脊椎动物谱系中CAPN2具有远源功能相关性。在软骨和鳍鱼进化中，CAPN2的独立复制具有重要作用，在复制过程中发生快速的蛋白质进化。CAPN8快速的进化实例在一些哺乳动物分支中也非常明显，表明发生了功能分化，与其他脊椎动物相对弱的纯化选择形成对比。
总之，这些分析表明，在经典calpain进化中，功能的分化断续地发生。尽管不如CAPN11那样富有戏剧性。然而，哺乳动物经典calpain功能的保守性仍然是必需的。
135跨越脊椎动物类群，经典calpain mRNA具有不同的表达
通过对4个脊椎动物物种分离的成熟组织的300多个经典calpain家族成员的mRNA表达情况的分析表明，不同的表达反映个体差异大，而进化变化小（图1-6）。
图1-6四种脊椎动物的成熟组织中完整经典calpain的mRNA表达情况
注：（a）斑马鱼，（b）非洲爪蛙，（c）变色蜥蜴，（d）猪。数据通过Northern dot blot杂交方式显示，通过qPCR数据分析rps13表达。系统发育树表明经典calpain基因间的关系
根据选择的数据，类群间表达密度存在很大的不同。在斑马鱼和一些青蛙中，不同的组织所有经典calpains均有一定程度的mRNA表达。相反，在变色蜥蜴和猪中，同一组织中，许多经典的calpains，包括CAPN8、CAPN13和CAPN14也很少检测到。比较猪和变色蜥蜴，主要的表达不同源于CAPN11从普遍存在表达转变为组织特异性表达，由于这些模式可追溯谱系间的进化年龄，所以经典calpains表达的边界在鳍鱼进化中降低，在羊膜动物特别是哺乳动物进化中变得更加专一化。
在猪中CAPN1和CAPN2的mRNA的表达为100%，而斑马鱼、青蛙和蜥蜴分别为31%、60%和18%。在斑马鱼、青蛙和变色蜥蜴中CAPN11 mRNA的表达分别为40%、20%和68%。除去羊膜动物，在同一组织中，CAPN13、CAPN12和CAPN17基因的表达在总的经典calpains表达中占很大一部分，斑马鱼占22%，青蛙占10%。
脊椎动物进化过程中经典calpains系统在系统分化中的作用的数据表明：在脊椎动物中通过组织表达特异性来划分calpains在实际应用中具有一定的局限性，忽略CAPN11表达的不同，在早期研究中，斑马鱼、青蛙和变色蜥蜴中CAPN8和CAPN9不是胃肠特异性的；而且“头发—毛囊—特异性”的CAPN12在许多物种中也不仅仅局限于单一组织。CAPN3在所有物种骨骼肌中mRNA的表达水平高，它也不是“骨骼肌—特异性”的，由于其在斑马鱼、青蛙和蜥蜴中表达水平也比较高，有时与“普遍存在的”calpain不相上下。CAPN13和CAPN14被称为“普遍存在表达”蛋白，尽管过去的报道不同，但其表达量在组织中从检测不同到非常丰富。
136人类中经典calpains的表达
研究人类EST资料中经典calpains基因的组织表达特性，这一工作由于一些偏见而难以开展，但在全球意义上是可信赖的，平均100 000 ESTs代表了45个人体组织。两个包括管家基因具有普遍存在表达图谱，所有的经典calpains基因在多种组织中表达，但表达边界有一定程度的不同（图1-7）。
图1-7人类组织中经典calpain家族成员mRNA转录水平的EST谱
注：每个点的大小代表独立家族成员的ESTs的数量除以整个组织中总的ESTs数量
CAPN1和CAPN2不是普遍存在表达的，在一定的组织中不存在，然而它们较其他经典calpain表达广泛。CAPN3在45个组织中有26个表达，与“肌肉特异性”划分相一致。有趣的是，人类CAPN3在皮肤中较肌肉ESTs中更具有代表性。然而CAPN8和CAPN9主要在肠胃中表达，其他组织中也有表达。CAPN11 mRNA仅局限于睾丸。CAPN12在45个组织中有16个组织表达，也与其分类一致。CAPN13和CAPN14在45个组织中分别有16个和5个组织表达。
总之，功能的多样性和谱系特异基因的扩张是脊椎动物经典calpain进化的总特征，这具有实际意义。同一calpains基因在不同的谱系中可能发挥不同的作用，因此，采用非哺乳动物的模型划分人类经典calpain是不合理的，应该以更低等的脊椎动物来研究完整的经典calpains系统的功能，特别是对于CAPN11、CAPN12、CAPN13和CAPN17，它们在哺乳动物中不发挥作用。
14人类的钙蛋白酶
人类中含有16个CAPNs:CAPN（1～3,5～17），其中典型的CAPNs有9个，CAPN1、CAPN2、CAPN3、CAPN8、CAPN9、CAPN11、CAPN12、CAPN13和CAPN14，其余的为非典型CAPNs，如图1-8所示。
图1-8人类calpain相关分子的系统进化树和结构示意
A. 人类calpain的系统进化树。使用MAFFT v6240法（在http://aligngenomejp/mafft/,策略：EINSi）绘制。非典型的calpains比典型的calpains更分散。PalB亚家族由严格的PalB组、TRA3组以及CAPN10组组成
B. 结构示意图：普遍存在的和组织或器官特异性的calpains。L和XL表示N端和N端延伸区域的calpastatin。其他符号标记见图1-1的图例
15其他物种中的钙蛋白酶
在其他种类中Schistosoma mansoni（图1-9），Caenorhabditis elegans（图1-10），Anopheles gambiae（图1-11），Drosophila melanogaster（图1-12），Arabidopsis thaliana（图1-2），Emericella（Aspergillus）nidulans（图1-2），或Saccharomyces cerevisiae（图1-2）分别有7个calpain基因、14个calpain基因、7个calpain基因、4个calpain基因；1个calpain基因、2个calpain基因和1个calpain基因。在Encephalitozoon或Schizosaccharomuces中没有calpain基因。在原核生物中，从914个完全测序的微生物基因组中的42个细菌中发现了53个calpain，每个细菌中有1～4个calpain，如图1-12所示，而大肠杆菌和古细菌中不含calpain。
图1-9Smansoni calpains的系统进化树和结构示意
ASmansoni和人类calpains的系统进化树。B结构示意图。人类calpains与Smansoni calpain非常相似，在括号中有标明，以氨基酸序列识别。通过XP002577797上的两个串联的经典calpain结构来识别。USP表示泛素特异性肽酶。其他符号标记如图1-3的图例
图1-10Celegans calpains的系统进化树和结构示意
ACelegans和人类calpains的系统进化树。B结构示意图。人类calpains与Celegans calpain非常相似，在括号中有标明，以氨基酸序列识别。CⅠ和CⅡ分别代表保守区Ⅰ和Ⅱ，且功能不知。其他符号标记见图1-3的图例
图1-11昆虫calpains的系统进化树和结构示意
A. Agambiae和人类calpains的系统进化树。方法见图1-3A。Dmelanogaster（DM）同源物如图所示。B结构示意图。人类calpain与昆虫 calpain非常相似，在括号中有标明，以氨基酸序列识别。Dmelanogaster calpain与Agambiae calpain表明也非常相似。Prich表示富含脯氨酸区；DIS表示Drosophila型插入序列
16线粒体中的钙蛋白酶
线粒体参与许多不同的过程，如凋亡、新陈代谢、疾病、老化、贮存和Ca2+的释放等（Goll，et al，2003；Ozaki，et al，2007）。在不同的病理生理环境下，［Ca2+］m浓度的增加会引发一系列破坏性的循环，对细胞的破坏是不可逆的。［Ca2+］i浓度的增加会造成钙蛋白酶活性的增加，随后细胞内的一些蛋白质会被限制性蛋白酶降解，这种影响会比其他可逆的钙依赖过程如磷酸化和去磷酸化产生更大的破坏（Ozaki，et al，2009；Arrington，et al，2006；Kar，et al，2007）。在缺血时，细胞内Ca2+的动态平衡改变，但是线粒体能够在一定程度上使细胞质中Ca2+的浓度得到缓冲，这就表明线粒体具有运输Ca2+的能力（Ferrari，1996a；Chalmers，Nicholls，2003b）。
在线粒体中，Ca2+主要由钌红敏感性转运体通过质子电化学梯度驱动，并主要由钠钙交换体介导Ca2+流动，从而导致连续的Ca2+再循环穿过线粒体膜，造成细胞质和线粒体中Ca2+水平的不断改变（Gobbi，et al，2007）。钠钙交换体介导的线粒体释放Ca2+是在生理学和病理生理学环境下［Ca2+］i浓度做出回应的一种形式，Drumond等人证明了［Ca2+］i的增加会造成［Ca2+］m的增加。在非正常生理环境下，［Ca2+］i浓度的升高导致线粒体失调，进而导致细胞机能失调（Drummond，Tuft，1999a；Reynolds，1999b）。在细胞凋亡中，广泛表达的CAPN1和CAPN2不断活化，使［Ca2+］i的浓度增加。特别是，CAPN1导致的线粒体膜内钠钙离子交换体的蛋白水解作用，在使Ca2+增加，通过凋亡诱导因子（AIF）的释放导致细胞的死亡过程中起到非常重要的作用（Kar，et al，2009；Norberg，et al，2008）。因此，线粒体钙蛋白酶能介导细胞死亡并与一些病理生理学环境下的许多疾病有密切的联系。
《钙蛋白酶系统》由中国农业科学技术出版社出版。
作者简介
作者为山西农业大学食品科技学院博士，教师。长期从事动物营养合成、微量元素分析以及畜禽肌肉神经系统对动物循环、内分泌等的生理生化反应等研究。
目录
1钙蛋白酶系统的研究史及分类
1.1钙蛋白酶的研究史及定义
1.2钙蛋白酶的命名
1.3钙蛋白酶的生物进化和分类
1.3.1脊椎动物的钙蛋白酶
1.3.2经典CAPNs进化的路线图
1.3.3理解经典CAPNs在脊椎动物发展史中的价值
1.3.4进化过程中赋予经典CAPNs的选择性特征
1.3.5跨越脊椎动物类群，经典calpainmRNA具有不同的表达
1.3.6人类中经典calpains的表达
1.4人类的钙蛋白酶
1.5其他物种中的钙蛋白酶
1.6线粒体中的钙蛋白酶
1.6.1线粒体中的钙蛋白酶
1.6.2线粒体钙蛋白酶的调控
1.6.3线粒体钙蛋白酶的功能
1.6.4线粒体钙蛋白酶在神经元细胞死亡
2钙蛋白酶系统具有显著特征的成员——CAPN1（μCL）、CAPN2（mCL）和CAST
2.1CAPN1（μCL）、CAPN2（mCL）的特性
2.1.1CAPN1（μCL）、CAPN2（mCL）的cDNA序列
2.1.2CAPN1和CAPN2的基因组序列
2.1.3CAPNs的3D结构研究
2.1.4CAPNs功能表达研究
2.1.5自溶和酶原问题
2.2CAST（calpastatin）的特性
2.2.1CAST的DNA序列
2.2.2CAST的结构域结构
2.2.3与CAPNs的结合
2.2.4CAST的遗传学研究
2.3CAPNs和CAST的纯化及活性检测
2.3.1CAPNs及CAST的分离提纯
2.3.2Caipains的活性测定
3钙蛋白酶系统的其他成员
3.1非经典CAPNs成员中的亚家族
3.1.1严格的PalB同系物（PalB亚家族中的PalB群）
3.1.2PalB亚家族的TRA—3群
3.1.3PalB亚家族的CAPN10群
3.1.4SOL亚家族
3.1.5植物calpain
3.1.6其他calpain成员
3.2普遍存在的组织特异性CAPNs
3.2.1组织特异性CAPNs的表达
3.2.2CAPN3（p94）
3.2.3CAPN8（nCL—2）和CAPN9（nCL—4）
4钙蛋白酶系统的活性调节
4.1钙离子对CAPNs的调节作用
4.1.1钙离子协助CAPNs对底物的精准定位
4.1.2钙离子直接结合于CAPNs的核心结构
4.1.3钙离子与CAPNs的其他结合位点
4.2CAPNs的自溶
4.2.1CAPN1和CAPN2的自溶是分子内反应
4.2.2体外人工纯化后的CAPN1和CAPN2的自溶反应
4.3小亚基解离对CAPNs的调节作用
4.3.1生理条件下，小亚基解离与否
4.3.2小亚基在CAPNs聚集中的作用
4.4CAPNs核心酶的作用
4.4.1抑制剂与CAPNs核心酶的结合
4.4.2使用CAPNs核心酶可以筛选理想的底物序列
4.4.3非核心结构域对CAPNs活性的辅助功能
4.4.4为何CAPN2核心酶的活性较差？
4.4.5其他CAPNs核心酶
4.5CAPNs磷脂化作用
4.6CAPNs活性的负调节——CAST
4.7钙蛋白酶是与膜结合、发生自溶而发挥蛋白酶活性的吗？
4.8钙蛋白酶是受Ca2+和钙蛋白酶抑制蛋白调节的吗？
4.9钙蛋白酶激活因子（CAPNsactivator）
4.9.1钙蛋白酶激活因子（UK114）的结构
4.9.2钙蛋白酶激活因子对钙蛋白酶的激活特性
4.9.3钙激活蛋白酶激活蛋白（UK114）研究进展
5钙蛋白酶系统与相关疾病
5.1CAPN3与相关疾病
5.1.1CAPN3与LGMD2A
5.1.2与CAPN3相作用的分子
5.1.3CAPN3的抑制和激活
5.1.4CAPN3可能参与细胞周期调控
5.1.5CAPN3对疾病的防御作用
5.2CAPNs系统与肿瘤
5.2.1CAPNs在癌症中的上调节或下调节
5.2.2CAPNs与细胞发育
5.2.3CAPNs和细胞迁移—侵袭
5.2.4非典型的和组织特异性的CAPNs与肿瘤的关系
5.3CAPNs系统与糖尿病
5.3.1CAPN10的结构、功能
5.3.2CAPN10与Ⅱ型糖尿病的作用
5.4CAPNs系统与眼部疾病
5.4.1LEC凋亡是白内障形成的细胞学基础
5.4.2CAPNs的激活在白内障发生机制中的作用
5.5胃肠特异性CAPNs
5.6CAPNs系统与阿尔茨海默症
5.6.1阿尔茨海默病的发病机理
5.6.2CAPNs在阿尔茨海默病症中的作用
5.7CAPNs系统与脑部疾病
5.7.1CAPNs与脑缺血疾病
5.7.2CAPNs与脑外伤、脊髓损伤、脱髓鞘性疾病等的神经元退变
6钙蛋白酶系统与肉的品质及肉的嫩化
6.1牛肉的品质性状
6.2影响畜禽肉品质的因素
6.2.1肉本身的因素
6.2.2屠宰前的影响因素
6.2.3宰后的影响因素
6.3有关牛肉用性状的基因
6.3.1有关牛的肉用品质基因标记的概述
6.3.2一些牛肉品质候选基因的概述
6.4钙蛋白酶系统与肉品质的关系
6.4.1CAPNs对肌肉／细胞骨架蛋白质的影响
6.4.2起始肌原纤维蛋白的转换
6.4.3促进肌肉微观组织结构的改变
6.4.4促进宰后动物肌体的蛋白质水解
6.4.5对肌肉嫩化的作用
6.5钙蛋白酶系统是动物宰后促进肌肉嫩化的重要酶系统
6.5.1宰后肉嫩化的机制：酶假说与钙理论
6.5.2内源蛋白酶在肉嫩化中的作用
6.6肉嫩化的方法及机理
6.6.1物理嫩化法
6.6.2化学嫩化法
6.6.3生物嫩化法
参考文献
序言
前言
PREFACE
钙蛋白酶系统CAPNs（Calpain system）是高度可调的、依赖于Ca2+的蛋白质水解酶系统。钙蛋白酶（calpain）的研究始于1964年，钙蛋白酶抑制蛋白CAST（calpastatin）的研究始于1976年，而钙蛋白酶激活蛋白（calpain activator）的研究始于1982年。钙蛋白酶系统的研究是畜牧学领域、医学领域和肉类科学领域的热门研究课题。
Calpain是一种钙激活中性半胱氨酸内肽酶(EC 342217)，分布于所有脊椎动物细胞中，在果蝇属和昆虫中发现了此酶，最新的研究发现植物细胞也含有此酶。虽然不同生物细胞中的钙激活蛋白酶的结构略有不同，但是，钙激活蛋白酶的结构都是由大小两个结构域组成。
钙蛋白酶系统的体外研究表明，CAPNs仅裂解蛋白质有限的专一位点，产生大的多肽片段，而不是分解成小肽或氨基酸。这些蛋白酶是高度可调、且依赖于Ca2+的蛋白水解酶系统复合体。该系统在许多细胞骨架蛋白的结合与分解中起—定作用，尤其对依附于质膜或亚细胞结构的细胞骨架纤维部位。CAPNs降解作用较彻底，导致横纹肌的肌原纤维Z盘裂解，从而使肌节部位断裂。因此，CAPNs在动物机体屠宰后，肌肉蛋白的水解引起肉的嫩化中起相当重要的作用。它还参与居间纤维的分解、神经丝蛋白的水解、表皮作用因子受体的降解、成肌细胞融合、磷酸化酶b激酶和蛋白激酶c的活性、类固醇激素结合蛋白的转化、血小板的凝集等。CAPNs不仅参与上述正常的细胞内级联信号转导，也与机体内发生的各种病理状态，肿瘤、局部缺血、老年性痴呆症、白内障、肌肉萎缩、脓毒、切东二氏综合征、炎症、关节炎、疟疾等各种疾病相关联。
迄今，钙蛋白酶系统已成为最广泛和深入研究的蛋白酶系统之一，美国、日本、法国、以色列、英国、加拿大和意大利等国家的科学家都对它产生了浓厚的兴趣。我国关于钙蛋白酶系统的研究始于20世纪90年代，本书作者曾于2006年出版过《钙激活蛋白酶与基础研究》一专著，本书更完整、系统地对钙蛋白酶系统的研究史、生物进化、系统命名、活性调节与结构的关系及与疾病的关系进行了叙述和总结。在书的撰写过程中作者还将近年来的科研成果进行了融合和整理，是一本该领域研究的系统性较强的学术专著。
本书由常泓和尹淑琴共同编著，其中第1章钙蛋白酶系统的研究史及分类、第二章钙蛋白酶系统具有显著特征的成员——CAPNI（μCL）、CAPN2（mCL）和CAST及第三章钙蛋白酶系统的其他成员由常泓编著；第四章钙蛋白酶系统的活性调节、第五章钙蛋白酶系统与相关疾病及第六章钙蛋白酶系统与肉的品质及肉的嫩化由尹淑琴编著。在编著过程中，研究生张晓红、周全和冯晓赟等同学协助提供资料并进行编辑审核，在此一并表示感谢。由于我们水平有限，加之钙蛋白酶涉及各学科领域广泛，学科发展迅速，书中的疏漏及不妥之处在所难免，殷切期待各位读者和同行的惠正。
本书适合于生物学、畜牧学、兽医学、食品科学、医学领域的研究生、科研人员和肉类科学工作者以及其他科学爱好者阅读参考。
编著者
2016年10月
文摘
〖1〗钙蛋白酶系统
〖1〗1钙蛋白酶系统的研究史及分类
1钙蛋白酶系统的研究史及分类
1964年,Gordon Guroff发现钙蛋白酶是一种细胞内的Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶（EC342217；Clan CA，C02家族）（Frickel，et al，2004；Silvennoinen，et al，2004）。在1990年之前，钙蛋白酶被称为CANP（calciumactivated neutral protease，Ca2+ 激活中性蛋白酶）、CASF（Ca2+ activated sarcoplasmic factor）、CDP（Ca2+ dependent protein），KAF（kinase activating factor）等。1990年后钙蛋白酶统称为calpain，缩写为CAPNs。钙蛋白酶存在于几乎所有真核生物及一少部分细菌中，但在古细菌中不存在。最近的研究发现植物中也存在钙蛋白酶。钙蛋白酶具有一定的蛋白酶水解活性，对底物的结构和活性具有转化或调节功能，所以被认为是一种调节蛋白酶。在人类基因组中，有15个基因，如CAPN1，CAPN2等，编码一个类似于钙蛋白酶的蛋白酶结构域。它们的产物都是钙蛋白酶的同源物，这种同源物具有不断变化的结构并且由不同的功能结构域组成。
11钙蛋白酶的研究史及定义
1964年，Gordon Guroff（1933—1999）从鼠脑中部分纯化得到一种依赖于Ca2+的中性蛋白酶，随后被证明是calpain（Guroff，1964）。同年，Meyer,Fischer和Krebs报道了被Ca2+激活的小鼠骨骼肌磷酸化酶b激酶和部分纯化的反应蛋白产物，他们称该酶为KAF（kinase activating factor）（Meyer，et al，1964）。4年后，Huston Krebs（Huston，Krebs，1968）和Drummond Duncan（Ono，et al，2016）分别报道了这种蛋白酶是依赖于Ca2+的蛋白酶，并证实了这种酶对磷酸化酶b激酶的蛋白水解激活作用不是生理必需的。Krebs和Fishers的研究兴趣便转向磷酸化及级联反应，于1992年获得诺贝尔奖（Fischer，Krebs，1955a；Krebs，Fischer，1955b），从此，Kerbs就改变了对蛋白水解激活的生理重要性的想法。1972年，Darrel EGoll和他的同事，鉴定了一种因子，它依赖于Ca2+打断骨骼肌Z线，并命名它为CASF（Ca2+ activated sarcoplasmic factor），这个因子随后也被证明是calpain（Busch，et al，1972），这一研究开始了calpain在肉的宰后嫩化中的作用的研究。1977年，Yasutomi Nishizuka和他的同事鉴定calpain为蛋白激酶c（PKC）的激活因子（Takai，et al，1977），并开辟了一系列calpain与PKC的相互联系研究（Takai，et al，1982a；Kishimoto，et al，1983b；Ogawa，et al，1981c；Kishimoto，et al，1981d）。1978年，Kazutomo Imahori（1920—)和他的同事首次纯化得到了单一组分的鸡钙蛋白酶，命名为CANP（Ishiura，et al，1978）。这一研究开启了钙蛋白酶系列的、重点的研究，并使钙蛋白酶成为细胞内重要的激活酶类（Suzuki，Ishiura，1983a；Suzuki，1983b；Suzuki，et al，1981）。随着这一里程碑式的研究工作的开辟，Imahori团队建立了calpain研究课题组，并发表了许多重要的研究报告，主要是关于底物特异性（Ishiura，et al，1979），人肌肉（Suzuki，et al，1979）中纯化calpain，抑制剂（Sugita，et al，1980a,b），自溶（Suzuki，et al，1981,）和激活（Suzuki，Tsuji，1982a；Suzuki，1982b）等。同年，Takashi Murachi(1926—1990)和他的同事报道了一种内源性钙蛋白酶特异性抑制蛋白（Nishiura，et al，1978），并在1981年提出以calpain代替CANP和以calpastatin为蛋白酶抑制剂的名称（Murachi，et al，1980）。1984年，Koichi Suzuki（19392010)和他的同事揭示了钙蛋白酶催化亚基（Ohno，et al，1984）的完整的一级结构，并且对钙蛋白酶的研究转向其结构与功能关系的研究。此后，CANP和calpain一直同时被使用。直到1990年，Suzuki和Imahori才解决了这一复杂的问题。在第八届蛋白质水解和蛋白质转换（Suzuki，1991）的国际会议上提出了calpain为授权名称。在1991年（Croall，DeMartino，1991）和2003（Goll，et al，2003）年的两个经典文献及以后的综述（Zatz，Starling，2005；Murachi，1990b；Yamashima，2004c；Wendt，et al，2004d；Wells，et al，2005e；Turner，et al，2005f；Tian，et al，2004g；Sorimachi，Kawabata，2003h；Ray，et al，2003i；Ridderstrle，et al，2005j；Ray，Banik，2003k；Nixon，2003；Mehendale，Limaye，2005m；Liu，et al，2004n；Laval，Bushby，2004o；Horikawa，2005p；Harwood，et al，2005q；Friedrich，et al，2004r；Franco，Huttenlocher，2005s；Costelli，et al，2005t；Carragher，2006u；Branca，2004v；Biswas，et al，2005w,2004x；Bartoli，Richard，2005y；Baud，et al，2003z；Kuchay，Chishti，2007；Liu，et al，2008；Bertipaglia，Carafoli，2007；Croall，Ersfeld，2007；Suzuki，et al，2004；Sorimachi，et al，1997）对calpains的研究做了详尽的阐述。
Calpain的纯化工作，1976年（Reville，et al，1976）为90%纯度，1978（Ishiura，et al，1978）年达到单一组分。研究最广泛的就是哺乳动物的μcalpain和mcalpain及鸡的μ/mcalpain，之后称它们为传统的calpains（Ohno，et al，1991）。鸡的μ/mcalpain（Suzuki，1991）是介于μcalpain和mcalpain之间的一种calpain（Ishiura，et al，1978,1979；Sorimachi，et al，1995），它的催化亚基与哺乳动物的CAPN11同源（Macqueen，et al，2010）。calpain的结构研究表明，calpain由大亚基（80kDa）和小亚基（30kDa）组成，这是另一个重要的calpain特性。
从1984年Suzuki的文章（Ohno，et al，1984）发表以后，cDNA基因克隆的研究迅速增长，鉴定了许多钙蛋白酶及相关分子，这些分子中包括15个人类calpain基因，现在称为CAPNn（n=1,2,3，和5～16）。有2个基因为calpain调节小亚基，CAPNS1和CAPNS2，CAST代表calpastatin。鸡μ/mcalpain的催化亚基的cDNA于1984（Ohno，et al，1984）年被克隆。其后，许多种类的calpain的cDNAs被克隆并测序。
在获得的氨基酸序列中，有一组肽酶含有蛋白酶结构域，这个蛋白酶结构域在这一组肽酶结构域中相互相似但却明显地区别于其他肽酶（Berti，Storer，1995）。在保守性结构域的NCBI（MarchlerBauer，et al，2009）数据库中搜索“CysPc”得到不同的生物有机体包括：植物、真菌、酵母菌，甚至细菌中几乎所有的calpain同源物的序列。因此，根据其氨基酸序列与哺乳动物μcalpain和mcalpain的相关性，calpain被定义为与人类μcalpain大亚基蛋白酶结构域具有氨基酸序列极度相似性的蛋白质。Calpain属于木瓜蛋白酶超级家族中的半胱氨酸蛋白酶，其结构分类和家族成员如图1-1和图1-2所示。
图1-1calpain超级家族的结构分类发展历史
图1-2CAPNs超家族成员的图表结构
注：Calpain同源物存在于几乎所有的真核生物及一少部分细菌中。在历史上，有一些系统命名法命名结构域。在本书中为避免混淆，这些结构域在相应的结构上写上其缩写，如：PC1（蛋白酶核心结构域1），PC2（蛋白酶核心结构域2），C2L（类似C2结构域），PEF（pentaEFhand）等。标记有：N和N端、PEF(L)和PEF(F)分别表示大催化亚基和小调节亚基的PEF结构域；GR表示富含Gly疏水结构域；AS表示选择性剪接产物；NS/IS1/IS2为CAPN3独特的序列。C2表示C2结构域；MIT表示微管相互作用和运输模型；Zn表示锌指结构；SOH表示SOL同源物结构域；DIS表示CALPA具体的插入序列；TM表示横跨膜的结构域；CSTN表示类似calpastatin结构域；IQ表示与钙调蛋白互动的模型
12钙蛋白酶的命名
早期钙蛋白酶的命名是由发现者根据来源、结构特点、分子大小等情况而确定的，随着钙蛋白酶研究的深入和一些会议的召开，该领域的专家一致同意采用基因—产物命名法，如下表所示，如哺乳动物CAPN1基因的产物为CAPN1（μcalpain催化大亚基，缩写为μCL）；CAPN2基因的产物为CAPN2（mcalpain催化大亚基，缩写为mCL）。方括号里的为旧名称，如CAPN1［μCL］和CAPN2［mCL］、CAPN3 ［P94 ］、CAPN5（hTRA3）、CAPN7（PalBH）、CAPN8［nCL2 ］、CAPN9（nCL4）、CAPN15（SOHL）和CAPN16（C6或f103）等。
13钙蛋白酶的生物进化和分类
根据CAPNs在组织中的表达情况，可以将其分为“普遍存在的”和“组织特异性”2种（Sorimachi，et al，2011；Ono，Sorimachi，2012），这种分类系统在过去10年的许多综述文章中都可以看到，在最近关于哺乳动物的文章中也可以查到。但是，最近一篇文献的报道与这一分类法不相符合，即“组织特异性”的CAPN3也表达于许多其他组织中，而不仅仅表达于肌肉组织（Farkas，et al，2003）。这一研究工作引起了一定的重视，一些过去被广泛认为的组织特异性表达的钙蛋白酶也可能在其他位点表达。
CAPNs研究的另一个局限就是大多研究都集中于哺乳动物，从这个意义上讲，我们所观察到的基因表达模式和功能是广泛适用于所有的生物吗？CAPNs家族的进化史研究充分说明了这一问题。CAPN11过去称为鸟中的μ/mcalpain，它在胎盘哺乳动物中以一种高度限制的方式表达，但它最初的功能是在各种组织中广泛表达（Macqueen，et al，2010），表明CAPN11在CAPNs家族中占有非常关键的位置；特别是CAPN1和CAPN2的标志性的普遍存在的基因型遗传自CAPN11,因此CAPN11的功能与CAPN1和CAPN2功能同样重要。尽管如此，各类综述文章都毫无疑问地称之为“组织特异性”CAPNs（Macqueen，et al，2010；Johnston，et al，2011），而且CAPN11的重要性被广泛地认为是不重要的。从这个角度来说，其他CAPNs在脊椎动物进化中的不同的表达和功能达到一个什么程度，目前还不知道。
131脊椎动物的钙蛋白酶
Macqueen DJ等从最新研究的200多个用贝叶斯系统发育分析中确定了脊椎动物谱系中经典CAPNs的序列（Macqueen，Wilcox，2014）。结果与目前关于经典关系的假说基本一致（Macqueen，et al，2010a；Jékely，Friedrich，1999b），仅有两个主要分支与以前的不同（图1-3和图1-4）。
图1-4脊椎动物谱系图1-3中经典CAPNs家族成员的统计进化树
1311CAPN13：所有经典calpain之父
进化树的根部将公认的人类CAPN13和CAPN14的序列从所有其他序列中分离出来（不包含七鳃鳗或鲨鱼/银鲛），人类CAPN14是四足动物序列的一部分，从人类CAPN13和其他总鳍鱼类的姐妹群中分离出来，在这个群中，腔棘鱼处于最早的一个分支，这就说明CAPN13和CAPN14分离的复制事件发生在腔棘鱼进化的早期。
腔棘鱼中的CAPN13/CAPN14分群，然后从辐鳍鱼纲序列组中分离出来。这表明，单一的经典的CAPNs(在腔棘鱼中进化为CAPN13或CAPN14)存在于有颚类脊椎动物祖先中。使用CAPN13这个名字(尽管CAPN14也一样)，是明显地区分究竟是CAPN13还是CAPN14在腔棘鱼中是祖先。
辐鳍鱼中的CAPN13分支序列表明：这种基因来源于硬骨鱼祖先基因组拷贝，许多硬骨鱼谱系中也含有另外的CAPN13分支，在发育树中紧靠着，常常在同一染色体上成簇存在。猪和袋獾有两个拷贝的CAPN14，是最近出现的。非洲蟾蜍含有2个CAPN13基因，而且可变性大，可能起源于两栖动物祖先，因此，许多脊椎动物保持多拷贝的CAPN13/14。CAPN13/14包含在非经典CAPNs中，这就表明，CAPN13是古老的经典CAPNs家族的成员。七鳃鳗中缺失CAPN13，说明或者是基因丢失，或者是在基因组组装中缺乏，因为七鳃鳗起源比硬骨鱼起源更早，存在于进化更早的经典CAPNs族中。这些发现扩大了有限的单个哺乳动物中CAPN13和CAPN14的进化起源和分布的数据（Ono，Sorimachi，2012；Sorimachi，et al，2011；Dear，et al，2000），而且与过去的分析一致。
1312CAPN17:与CAPN12相关的一个新的CAPNs
在进化树上，还排列着3个大的分支，分离成3组序列。一个是鳍鱼；中间有七鳃鳗、两栖类、加上鳍鱼；最后一个是四足动物，包括人类CAPN12（图1-3）。这种分类法存在争议，表明存在分支错误，因此采用序列独立进化树分析（图1-5）。结果，进化树分成两个而不是3个分支，前面分开的鳍鱼和三足动物便隶属于一个群，与想象的种间关系一致。这个群包含人类CAPN12，表明CAPN12在有骨脊椎动物中保守。然而七鳃鳗、鲨鱼和银鲛却不在此群。同样也没有证据证明CAPN12在任何代表性的谱系中进行复制，这些数据证明了根据单一哺乳动物获得的CAPN12进化史。CAPN12的姐妹群，由准确的序列分类组成，七鳃鳗位于分支的最深处。这一分类说明存在一个新的经典的CAPNs家族成员,比所有脊椎动物都早，但在通常的陆生脊椎动物祖先中失去。我们命名此新的CAPNs为CAPN17，与现存的命名法一致。鲨鱼和银鲛中没有CAPN17，也没有任何证据证明在任何脊椎动物谱系中存在基因复制。
图1-5贝叶斯系统发育分析图1-4中经典CAPNs序列形成的虚拟错误分组
1313CAPN3和CAPN9存在于常见的脊椎动物祖先中
CAPN12/17内部序列可分为两个主要群。第一个群包含人类CAPN9，以所有主要脊椎动物谱系为代表(除了七鳃鳗)，这种分支模式遵循预期的物种关系。第二个群包含人类CAPN3，以所有主要脊椎动物为代表，这个群中最古老的两个分支都是七鳃鳗，这个模式与现存的单一的脊椎动物CAPNs家族成员不一致。一个原因就是通常的脊椎动物祖先有两个CAPN3基因，其中一个在有颚类进化过程中消失了，或者考虑其统计水平较低，如：更深的分支七鳃鳗序列就能代表了一个CAPN9基因。我们观察到，主要的硬骨鱼谱系中代表了两个CAPN3群，与基因组复制中保存一对复制相一致。总之，这些数据表明，CAPN3和CAPN9存在于通常的脊椎动物祖先中。
1314有颚类脊椎动物也含有主要经典钙蛋白酶
在CAPN3和9的内部分出一大支，包括人类CAPN1、CAPN2、CAPN8和CAPN11。这个群中得到最大认可的最深的分支就是七鳃鳗序列，这表明，在通常的脊椎动物祖先中拥有一个转变为CAPN1、CAPN2、CAPN8和CAPN11的原基因。
七鳃鳗的内部的一个分支是胎盘哺乳动物CAPN11序列群，由其他脊椎动物CAPN11序列群分离出来。这个CAPN11群的分离是一个过去观察到的分支错误，正确的CAPN11分群，得到广泛的进化树和共线性数据支持，存在于统计树中，由于CAPN11存在于鲨鱼/银鲛中，所以这些数据就支持CAPN11存在于有颚类脊椎动物祖先中。
分离CAPN11群，我们观察到一个群，包含人类CAPN1，物种覆盖其余的有颚类脊椎动物，分支模式与种群关系一致，表明CAPN1是有颚类脊椎动物的一个祖先。
分离CAPN1群，我们观察到两个群，分别包含CAPN2和CAPN8。CAPN2群主要以有颚类脊椎动物群为代表，有证据证明在明显的脊椎动物谱系中存在CAPN2的复制，如鲨鱼和银鲛序列分成两个姐妹群，以4亿年前分离的谱为代表。
鳍鱼可分成两个群，以斑点雀鳝和硬骨鱼类为代表，这表明，基因重复发生在此谱系分离前，约4亿年。另外，在鳍鱼CAPN2群内部，硬骨鱼又进一步分群。表明，在硬骨鱼祖先基因组复制中保留了另外的基因重复。
CAPN8群，以鳍鱼和叶鳍鱼为代表，但是没有鲨鱼和银鲛，然而由于CAPN2群含有鲨鱼/银鲛，所以就要求有颚类脊椎动物祖先有CAPN8。鳍鱼CAPN8序列分成两个群，与重复事件一致，存在于硬骨鱼祖先中。XXenopus保留CAPN8基因的3个拷贝。
132经典CAPNs进化的路线图
目前的研究结果表明，通常的脊椎动物祖先至少拥有6个经典的CAPNs，CAPN13、CAPN12、CAPN17、CAPN3和CAPN9和 CAPN11/1/2/8的原基因。过去的研究表明，在脊椎动物中，CAPN1和CAPN2产生于基因组倍增。目前认为，这种基因组倍增也发生于有颚类脊椎动物和七鳃鳗祖先中。因此，目前的数据表明：CAPN11、CAPN1、CAPN2和CAPN8产生于基因组倍增中。七鳃鳗的进化位置位于CAPN11、CAPN1、CAPN2和CAPN8之前是错误的。
133理解经典CAPNs在脊椎动物发展史中的价值
除哺乳动物外，脊椎动物CAPNs的鉴定是一项非常艰巨的任务。例如，假如开始这项调查工作采用Ensembl数据库，研究将面临的一个问题就是：大量的基因没有鉴定或者频繁地被错误注释。我们的工作使Ensembl数据库中命名已经确定的经典CAPNs序列被划分到受到广泛认可的系统发育群中。假如研究物种在我们的研究中没有代表，那么就BLAST，根据最近的相关物种来确定其相关的进化种群。
134进化过程中赋予经典CAPNs的选择性特征
经典calpains根据有颚类脊椎动物进化中纯化选择的优势划分为几个等级。CAPN3经历了最强的纯化选择，然后依次为CAPN1、CAPN12、CAPN9、CAPN2、CAPN8、CAPN11、CAPN17和CAPN13。排除哺乳动物，对于大多数有颚类脊椎动物，CAPN11在进化中受到最强的相对纯化选择，其功能非常重要。与此形成鲜明对比的是，在有胎盘类哺乳动物中，CAPN11和CAPN13是最不保守的经典的calpains，而CAPN13与CAPN11相比，在脊椎动物进化树中，一直经历着功能的变化。
CAPN2在高级保守的脊椎动物经典calpains中没有被划分出来，在不同脊椎动物谱系中CAPN2具有远源功能相关性。在软骨和鳍鱼进化中，CAPN2的独立复制具有重要作用，在复制过程中发生快速的蛋白质进化。CAPN8快速的进化实例在一些哺乳动物分支中也非常明显，表明发生了功能分化，与其他脊椎动物相对弱的纯化选择形成对比。
总之，这些分析表明，在经典calpain进化中，功能的分化断续地发生。尽管不如CAPN11那样富有戏剧性。然而，哺乳动物经典calpain功能的保守性仍然是必需的。
135跨越脊椎动物类群，经典calpain mRNA具有不同的表达
通过对4个脊椎动物物种分离的成熟组织的300多个经典calpain家族成员的mRNA表达情况的分析表明，不同的表达反映个体差异大，而进化变化小（图1-6）。
图1-6四种脊椎动物的成熟组织中完整经典calpain的mRNA表达情况
注：（a）斑马鱼，（b）非洲爪蛙，（c）变色蜥蜴，（d）猪。数据通过Northern dot blot杂交方式显示，通过qPCR数据分析rps13表达。系统发育树表明经典calpain基因间的关系
根据选择的数据，类群间表达密度存在很大的不同。在斑马鱼和一些青蛙中，不同的组织所有经典calpains均有一定程度的mRNA表达。相反，在变色蜥蜴和猪中，同一组织中，许多经典的calpains，包括CAPN8、CAPN13和CAPN14也很少检测到。比较猪和变色蜥蜴，主要的表达不同源于CAPN11从普遍存在表达转变为组织特异性表达，由于这些模式可追溯谱系间的进化年龄，所以经典calpains表达的边界在鳍鱼进化中降低，在羊膜动物特别是哺乳动物进化中变得更加专一化。
在猪中CAPN1和CAPN2的mRNA的表达为100%，而斑马鱼、青蛙和蜥蜴分别为31%、60%和18%。在斑马鱼、青蛙和变色蜥蜴中CAPN11 mRNA的表达分别为40%、20%和68%。除去羊膜动物，在同一组织中，CAPN13、CAPN12和CAPN17基因的表达在总的经典calpains表达中占很大一部分，斑马鱼占22%，青蛙占10%。
脊椎动物进化过程中经典calpains系统在系统分化中的作用的数据表明：在脊椎动物中通过组织表达特异性来划分calpains在实际应用中具有一定的局限性，忽略CAPN11表达的不同，在早期研究中，斑马鱼、青蛙和变色蜥蜴中CAPN8和CAPN9不是胃肠特异性的；而且“头发—毛囊—特异性”的CAPN12在许多物种中也不仅仅局限于单一组织。CAPN3在所有物种骨骼肌中mRNA的表达水平高，它也不是“骨骼肌—特异性”的，由于其在斑马鱼、青蛙和蜥蜴中表达水平也比较高，有时与“普遍存在的”calpain不相上下。CAPN13和CAPN14被称为“普遍存在表达”蛋白，尽管过去的报道不同，但其表达量在组织中从检测不同到非常丰富。
136人类中经典calpains的表达
研究人类EST资料中经典calpains基因的组织表达特性，这一工作由于一些偏见而难以开展，但在全球意义上是可信赖的，平均100 000 ESTs代表了45个人体组织。两个包括管家基因具有普遍存在表达图谱，所有的经典calpains基因在多种组织中表达，但表达边界有一定程度的不同（图1-7）。
图1-7人类组织中经典calpain家族成员mRNA转录水平的EST谱
注：每个点的大小代表独立家族成员的ESTs的数量除以整个组织中总的ESTs数量
CAPN1和CAPN2不是普遍存在表达的，在一定的组织中不存在，然而它们较其他经典calpain表达广泛。CAPN3在45个组织中有26个表达，与“肌肉特异性”划分相一致。有趣的是，人类CAPN3在皮肤中较肌肉ESTs中更具有代表性。然而CAPN8和CAPN9主要在肠胃中表达，其他组织中也有表达。CAPN11 mRNA仅局限于睾丸。CAPN12在45个组织中有16个组织表达，也与其分类一致。CAPN13和CAPN14在45个组织中分别有16个和5个组织表达。
总之，功能的多样性和谱系特异基因的扩张是脊椎动物经典calpain进化的总特征，这具有实际意义。同一calpains基因在不同的谱系中可能发挥不同的作用，因此，采用非哺乳动物的模型划分人类经典calpain是不合理的，应该以更低等的脊椎动物来研究完整的经典calpains系统的功能，特别是对于CAPN11、CAPN12、CAPN13和CAPN17，它们在哺乳动物中不发挥作用。
14人类的钙蛋白酶
人类中含有16个CAPNs:CAPN（1～3,5～17），其中典型的CAPNs有9个，CAPN1、CAPN2、CAPN3、CAPN8、CAPN9、CAPN11、CAPN12、CAPN13和CAPN14，其余的为非典型CAPNs，如图1-8所示。
图1-8人类calpain相关分子的系统进化树和结构示意
A. 人类calpain的系统进化树。使用MAFFT v6240法（在http://aligngenomejp/mafft/,策略：EINSi）绘制。非典型的calpains比典型的calpains更分散。PalB亚家族由严格的PalB组、TRA3组以及CAPN10组组成
B. 结构示意图：普遍存在的和组织或器官特异性的calpains。L和XL表示N端和N端延伸区域的calpastatin。其他符号标记见图1-1的图例
15其他物种中的钙蛋白酶
在其他种类中Schistosoma mansoni（图1-9），Caenorhabditis elegans（图1-10），Anopheles gambiae（图1-11），Drosophila melanogaster（图1-12），Arabidopsis thaliana（图1-2），Emericella（Aspergillus）nidulans（图1-2），或Saccharomyces cerevisiae（图1-2）分别有7个calpain基因、14个calpain基因、7个calpain基因、4个calpain基因；1个calpain基因、2个calpain基因和1个calpain基因。在Encephalitozoon或Schizosaccharomuces中没有calpain基因。在原核生物中，从914个完全测序的微生物基因组中的42个细菌中发现了53个calpain，每个细菌中有1～4个calpain，如图1-12所示，而大肠杆菌和古细菌中不含calpain。
图1-9Smansoni calpains的系统进化树和结构示意
ASmansoni和人类calpains的系统进化树。B结构示意图。人类calpains与Smansoni calpain非常相似，在括号中有标明，以氨基酸序列识别。通过XP002577797上的两个串联的经典calpain结构来识别。USP表示泛素特异性肽酶。其他符号标记如图1-3的图例
图1-10Celegans calpains的系统进化树和结构示意
ACelegans和人类calpains的系统进化树。B结构示意图。人类calpains与Celegans calpain非常相似，在括号中有标明，以氨基酸序列识别。CⅠ和CⅡ分别代表保守区Ⅰ和Ⅱ，且功能不知。其他符号标记见图1-3的图例
图1-11昆虫calpains的系统进化树和结构示意
A. Agambiae和人类calpains的系统进化树。方法见图1-3A。Dmelanogaster（DM）同源物如图所示。B结构示意图。人类calpain与昆虫 calpain非常相似，在括号中有标明，以氨基酸序列识别。Dmelanogaster calpain与Agambiae calpain表明也非常相似。Prich表示富含脯氨酸区；DIS表示Drosophila型插入序列
16线粒体中的钙蛋白酶
线粒体参与许多不同的过程，如凋亡、新陈代谢、疾病、老化、贮存和Ca2+的释放等（Goll，et al，2003；Ozaki，et al，2007）。在不同的病理生理环境下，［Ca2+］m浓度的增加会引发一系列破坏性的循环，对细胞的破坏是不可逆的。［Ca2+］i浓度的增加会造成钙蛋白酶活性的增加，随后细胞内的一些蛋白质会被限制性蛋白酶降解，这种影响会比其他可逆的钙依赖过程如磷酸化和去磷酸化产生更大的破坏（Ozaki，et al，2009；Arrington，et al，2006；Kar，et al，2007）。在缺血时，细胞内Ca2+的动态平衡改变，但是线粒体能够在一定程度上使细胞质中Ca2+的浓度得到缓冲，这就表明线粒体具有运输Ca2+的能力（Ferrari，1996a；Chalmers，Nicholls，2003b）。
在线粒体中，Ca2+主要由钌红敏感性转运体通过质子电化学梯度驱动，并主要由钠钙交换体介导Ca2+流动，从而导致连续的Ca2+再循环穿过线粒体膜，造成细胞质和线粒体中Ca2+水平的不断改变（Gobbi，et al，2007）。钠钙交换体介导的线粒体释放Ca2+是在生理学和病理生理学环境下［Ca2+］i浓度做出回应的一种形式，Drumond等人证明了［Ca2+］i的增加会造成［Ca2+］m的增加。在非正常生理环境下，［Ca2+］i浓度的升高导致线粒体失调，进而导致细胞机能失调（Drummond，Tuft，1999a；Reynolds，1999b）。在细胞凋亡中，广泛表达的CAPN1和CAPN2不断活化，使［Ca2+］i的浓度增加。特别是，CAPN1导致的线粒体膜内钠钙离子交换体的蛋白水解作用，在使Ca2+增加，通过凋亡诱导因子（AIF）的释放导致细胞的死亡过程中起到非常重要的作用（Kar，et al，2009；Norberg，et al，2008）。因此，线粒体钙蛋白酶能介导细胞死亡并与一些病理生理学环境下的许多疾病有密切的联系。
| ISBN | 9787511629043 |
|---|---|
| 出版社 | 中国农业科学技术出版社 |
| 作者 | 常泓 |
| 尺寸 | 16 |